大肠杆菌噬菌体Φ199一步生长曲线、与盐酸克林霉素体外联合应用效果（二）
1.3透射电镜观察
噬菌体培养至10^8 PFU/mL，取10μL转移至铜网格上，静置10 min待其吸附于铜网格后，用滤纸吸去多余液体，滴加10μL磷钨酸(PTA，2%)，自然风干5 min后使用H7650透射电子显微镜(Hitachi，Japan)观察噬菌体结构。
1.4最佳MOI测定
最佳MOI是指噬菌体与细菌的数量在此比值下，噬菌体处于最佳复制状态。O157:H7大肠杆菌培养至对数期，用LB培养基稀释至1×10^7 CFU/mL，用SM液稀释噬菌体，使噬菌体与细菌的MOI为0.001、0.01、0.1、1、10和100。取200μL菌液和噬菌体液，混合均匀后置于37℃、180 r/min摇床中孵育5 h。10 000 g离心8 min，吸取上清液过滤。滤液通过10倍比稀释以及双层平板计数法测定噬菌体效价，效价最高的MOI为最佳感染复数。每组重复3次。
1.5一步生长曲线测定
取1 mL噬菌体Φ199和1 mL O157:H7以最佳MOI混合均匀，37℃静置孵育10 min。孵育结束后，10 000 g离心8 min，用2 mL的LB培养基洗涤2次以去除没有吸附于细菌上的噬菌体。用预热至37℃的5 mL LB培养基重悬沉淀，置于37℃、180 r/min摇床中孵育，每间隔5~10 min取出菌液进行倍比稀释，双层平板法测定噬菌体效价。每组重复3次。
1.6裂解曲线测定
取1 mL浓度为1×10^8 CFU/mL的大肠杆菌O157:H7，用LB洗涤3次后稀释10倍至1×10^7 CFU/mL。按照最佳MOI各取100μL噬菌体和菌液，混匀后加入96孔板中。取稀释好的菌液和LB各100μL，混匀后加入96孔板中，作为菌液对照。取200μL LB加入96孔板中，作为空白对照。每组重复3孔。酶标仪设置参数为恒温37℃，180 r/min震荡，持续12 h，每30 min检测1次OD600 nm值，将所得数值绘制体外裂解曲线。
1.7噬菌体热稳定性和pH稳定性
在每个1.5 mL的EP管中加入500μL噬菌体，分别置于40、50、60、70、80和90℃中孵育，每隔30 min取出100μL噬菌体液用SM液10倍倍比稀释，通过双层平板法测定噬菌体效价，一共孵育1.5 h。每组重复3次。
利用盐酸和NaOH调节SM液体的pH值，配制成pH值为2~13的SM液。在1.5 mL的EP管中分别加入900μL不同pH值的SM液和100μL的噬菌体，混匀后于37℃培养箱中孵育1 h，最后取出培养液进行10倍倍比稀释以及双层平板法测定噬菌体效价。每组重复3次。
1.8盐酸克林霉素最小抑菌浓度(MIC)测定
采用96孔U型板测量盐酸克林霉素的MIC。配制盐酸克林霉素母液为256 mg/mL，用MH培养液稀释至512μg/mL。在96孔板中第2~10孔每孔加入100μL MH培养基，在第1、2孔中加入100μL盐酸克林霉素稀释液，第2孔开始混匀，2倍稀释，依次稀释至第10孔。大肠杆菌培养至对数期，用MH培养基稀释至1×10^6 CFU/mL，每孔加入50μL菌液，第12孔加入50μL MH培养基。同时设置阳性对照组(大肠杆菌+MH培养基)和阴性对照组(MH培养基)。96孔板置于37℃培养箱中培养12 h。使用酶标仪检测每孔在600 nm处OD值。每组重复3次。
1.9噬菌体Φ199和盐酸克林霉素体外联合应用
首先配制512μg/mL的抗生素稀释液，在96孔板中每孔加入100μL MH培养液并通过倍比稀释方法进行抗生素稀释。大肠杆菌培养至对数期，用MH培养基稀释至1×10^6 CFU/mL，每孔加入50μL菌液。准备效价为10^5~10^8 PFU/mL的噬菌体Φ199稀释液，第1行到第4行加入50μL浓度分别为10^5、10^6、10^7和10^8 PFU/mL噬菌体，使每孔含200μL液体，具体加样方式如图1所示。
(图1：噬菌体Φ199和盐酸克林霉素体外联合应用加样示意)
同时设置阳性对照和阴性对照。随后将96孔板置于37℃培养箱中培养12 h，使用酶标仪检测每孔在600 nm处OD值，计算抗菌效率。公式如下：抗菌效率%=(对照组OD600 nm值-试验组OD600 nm值)/对照组OD600 nm值。试验重复3次取平均值。
2结果
2.1噬菌体Φ199及其噬菌斑的形态特征
如图2A所示，噬菌体Φ199的噬菌斑形态为圆形，透亮的空斑，边缘清晰，直径约为2 mm。透射电镜观察显示(图2B)，噬菌体Φ199病毒颗粒头部是直径约为50 nm的二十面体，具有可以收缩的尾部，长度约为100 nm，属于肌尾型噬菌体。
(图2：A.噬菌体Φ199形成的噬菌斑形态；B.噬菌体Φ199负染后的电镜图(比例尺=50 nm))
2.2噬菌体Φ199最佳MOI
如图3所示，噬菌体Φ199的效价在MOI为0.01~100时均能够达到10^8 PFU/mL，并且在MOI为1时，噬菌体的滴度最高为9.24×10^8 PFU/mL，因此噬菌体Φ199与宿主菌O157:H7的最佳MOI为1。
(图3：噬菌体Φ199的最佳MOI)
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