铁皮、叠鞘石斛提取物对沙门氏菌生长状况、群体运动的影响——摘要、材料与设备
摘 要 传统抑菌剂的泛用使细菌表现出日趋严重的耐药性,以群体感应系统为靶点的新型抑菌剂具有不使细菌产生耐药性的优势。该研究旨在为开发天然产物作为新型抑菌剂提供理论支持。以沙门氏菌为受试菌株,测定铁皮、叠鞘石斛提取物对沙门氏菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),通过生长曲线实验、泳动实验和生物膜实验研究提取物对沙门氏菌生长状况、运动能力和生物膜生成能力的影响,通过HPLC分析提取物中的主要成分,通过分子对接模拟探究提取物对沙门氏菌群体感应系统的作用机制。结果显示,铁皮石斛提取物的MIC为8 mg/mL,叠鞘石斛提取物的MIC为4 mg/mL,在亚抑菌浓度下,沙门氏菌的生长不受影响,但运动能力和产生物膜能力均受到抑制(P<0.05),抑制效果呈现剂量依赖性,2种提取物均含有异鼠李素、金丝桃苷、槲皮素这3种单体成分,活性单体均能与LuxS蛋白相结合,提示提取物通过活性单体与受体蛋白结合来抑制致病因子表达实现抑菌作用。
沙门氏菌是常见的肠道致病菌,常引起人、食品和动物之间的循环感染,并呈现全球分布。近年来随着抑菌剂的泛用,沙门氏菌的耐药性和抗性问题日趋严重。群体感应(quorum sensing,QS)是细菌产生QS信号分子并释放至胞外环境中,当环境中的信号分子浓度达到一定阈值,就能与相应受体蛋白结合,激活靶基因表达,调控菌体的群体行为。研究表明,沙门氏菌的QS系统可分为3类:酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactone, AHL)介导的Ⅰ型系统、LuxS介导的Ⅱ型系统和AI-3/Epi/NE介导的Ⅲ型系统。沙门氏菌通过SdiA(suppressor of celldivision inhibition A)受体蛋白识别外环境中其他细菌产生的AHL信号分子生成SdiA-AHL复合体激活rck操纵子基因座表达,而rck操纵子正是沙门氏菌菌毛合成,增强抵抗血清抗体和生物膜形成的基因座。LuxS是一种小分子金属酶,其作用是催化细菌活化甲基化循环的最后一步S-核糖高半胱氨酸转化为4,5-二羟基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2,3-pentandione,DPD),DPD能与水反应生成QS信号分子AI-2的前体,环境中的AI-2进入沙门氏菌细胞后,会激活沙门氏菌的鞭毛基因和相关毒力基因的表达。AI-3由胃肠道菌群产生,尽管AI-3不直接依赖于LuxS合成,但是LuxS突变对AI-3的产生会造成影响。综上可知沙门氏菌的QS系统主要由LuxS蛋白调控,沙门氏菌毒力因子的表达受QS系统影响。因此研究基于QS系统的新型沙门氏菌抑菌剂,对缓解目前沙门氏菌耐药性和抗性严重的局面有积极作用。
群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitor,QSI)是在不抑制细菌正常生长的条件下通过抑制QS系统调控细菌生理活动,从而降低细菌致病力和侵袭力的物质。许多细菌的毒力因子(毒素、蛋白酶和免疫逃避因子)受QS系统的AHL信号分子调控,使得靶点QS开发新型抑菌剂有望成为破除沙门氏菌对越来越多抗生素耐药局面的方式。与细菌耐药性密切相关的生物膜形成过程与受QS系统调控的生物发光、毒力因子合成等过程具有进化上的相关性,靶向QS干扰旨在降低毒力并抑制生物膜,但并不杀死细菌,故而与传统抗生素相比,它不会施加选择性压力,因此不太可能使细菌产生耐药性。近年来,鉴于天然产物具有安全、低毒和来源广泛的特点,将天然产物作为QSI已成为研究热点。研究证明植物来源的天然产物中发挥抗QS系统活性的物质多为黄酮类化合物,而主产于四川、云南、贵州等地的石斛正含有多种黄酮类单体。铁皮石斛和叠鞘石斛是主要的川产石斛品种,大力发展石斛种植基地是夹江县重要的乡村振兴战略,对石斛提取物功能活性的研究为进一步探索铁皮石斛和叠鞘石斛的市场价值提供实验基础和理论支撑。
1 材料与设备
1.1 材料
受试菌株人肠道沙门氏菌,成都医学院公共卫生学院实验中心保存;铁皮石斛干茎和叠鞘石斛干茎,夹江县秧花石斛种植专业合作社。
1.2 试剂
琼脂、LB肉汤培养基,北京索莱宝科技有限公司;甲醇、乙腈、甲酸,均为LC-MS级,上海麦克林生化科技股份有限公司。
泳动培养基(g/L):胰蛋白胨10,NaCl 5,琼脂5,葡萄糖5。
1.3 仪器
SW-CJ-1FD-Ⅱ超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;BPH-9082恒温培养箱,致微(厦门)仪器有限公司;WMLL-125B干热灭菌箱,上海龙跃仪器设备有限公司;1510多功能酶标仪,德国PerkinElmer公司;5415R高速冷冻离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司;SR3000系列高效液相色谱仪,安徽皖仪科技股份有限公司;丹麦Biosense微生物生长动态监测系统。
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