铁皮、叠鞘石斛提取物对沙门氏菌生长状况、群体运动的影响——实验方法
2 实验方法
2.1 石斛提取物制备
根据课题组前期建立的方法。将石斛和水按照料液比1∶10(g∶mL)进行溶解,100 ℃沸水回流2 h。取上清液于离心管中,10 000 r/min高速离心15 min。取上清液,90 r/min、50 ℃旋转蒸发仪旋转蒸发1 h。将所得物于干燥箱60 ℃烘干过夜。取烘干后物质冷冻干燥12 h,将所得物质置于干燥箱备用。
2.2 最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)确定
制备菌悬液。挑取单菌落溶于生理盐水中,倍比稀释后至0.5麦氏浓度对照,选择此稀释度的菌悬液参与实验。制备实验组培养基。将提取物溶解于LB肉汤培养基中,用倍比稀释法制的质量浓度梯度为32、16、8、4、2、1、0 mg/mL的含石斛提取物的液体培养基,37 ℃培养24 h,测定波长为600 nm的吸光度值,以吸光度值骤降的浓度作为提取物的MIC,后续实验均在亚抑菌浓度下进行。实验重复3次。
2.3 石斛提取物对沙门氏菌生长状况的影响
取活化的沙门氏菌,制备0.5个比浊单位的菌悬液,以1∶100的体积比接种于LB肉汤培养基中,添加亚抑菌浓度梯度的石斛提取物,取等量灭菌生理盐水加于等浓度梯度的含石斛提取物培养基中,作为消除色差组。置于全自动生长仪中37 ℃、160 r/min培养48 h,每隔2 h测定波长为600 nm的吸光度值,用实验组吸光度减去消除色差组吸光度作为最终结果。实验重复3次。
2.4 石斛提取物对沙门氏菌群体运动的影响
向泳动培养基中加入经0.22 μm滤膜除菌的石斛提取物,使其终浓度为亚抑菌浓度梯度。充分混匀后倾倒平板,待平板冷却后向平板中央滴加2 μL沙门氏菌菌液,无菌风吹干,置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h,观察并用游标卡尺测量迁移圈直径。比较迁移直径的大小。实验重复3次。
2.5 石斛提取物对沙门氏菌生物膜的影响
配制2种石斛提取物浓度梯度的液体培养基,在96孔板的A1～E1中每孔加入100 μL培养基,再向E1中加入100 μL 16 mg/mL的石斛提取物的培养基,混匀。在E1中吸取100 μL培养基加入D1中,混匀。梯度稀释至B1,混匀后弃去100 μL培养基。向F1中加入100 μL 16 mg/mL的石斛提取物的液体培养基。每个浓度横向重复3个复孔。在A5～F8孔重复该步骤。在A1～F4孔中每孔加入10 μL OD600=0.1的菌液,A5～F8孔设置加生理盐水作为对照组。将96孔板置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h,取出,弃去培养基,无菌水清洗3遍,甲醇固定,置于超净工作台中吹干。用结晶紫染液染色,静置15 min,无菌水清洗3遍,吹干。加入乙酸溶液溶解10 min,并将液体转移至另一96孔板中,测波长为590 nm的吸光度值。实验重复3次。
2.6 提取物的HPLC分析
采用HPLC技术对2种石斛提取物的成分进行分析。色谱柱:Waters ACQUITYUPLCBEH C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,1.8 μm),流动相:0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)。梯度洗脱程序:0～6 min,5%～25% B;6～20 min,25%～40% B;20～25 min,40%～50% B,25～30 min;50%～5% B;流速0.60 mL/min;柱温40 ℃;进样量1.0 μL;紫外分光检测器条件360 nm。
2.7 分子对接模拟
通过分子对接验证活性单体与靶点的结合情况。本研究使用的分子对接程序AutoDock Vina (Vina 1.1.2)是一款采用半灵活对接方式运行的程序,对接精度高达78%。LuxS蛋白的晶体结构为5V2W,从RCSB(https://www.pdb.org/)获得。小分子的结构文件来源于PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。将活性单体成分(mol.2格式)作为配体,LuxS蛋白(pdb格式)为小分子蛋白对接的受体。Autodock Tools 用于加氢,电荷检查,分配原子类型为AD4类型,计算gasteiger电荷,构建蛋白质结构的对接网格,并在Autodock Tools中指定配体中的可旋转键,使用Discovery Studio 4.5软件进行作用力分析和可视化图处理。
2.8 数据统计分析
实验数据采用Origin 2022进行统计分析,采用SPSS 22.0进行差异显著性分析,数据结果表示为“平均值±标准偏差”,组间差异比较采用单因素方差分析,采用t检验,P<0.05具有差异。
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