沼泽红假单胞菌R1菌株的培养基配方、培养条件、生长量及影响因素（一）
近年来，杜冰等（2007）对沼泽红假单胞菌的生长条件进行了研究，发现pH值、温度、接种量等因素影响沼泽红假单胞菌的生长，并且它们之间又相互影响。夏冰冰等（2010）对沼泽红假单胞菌发酵条件进行了响应面优化研究。全亚玲等（2012）对沼泽红假单胞菌发酵培养基配方及培养条件进行了优化研究，采用单因素试验设计分别对本实验室保藏的沼泽红假单胞菌培养的接种量、pH值、温度、光照强度四种因素的不同水平进行比较试验，确定其各自最佳试验水平；确定了最佳培养基组成配方。本试验旨在对实验室保藏的沼泽红假单胞菌R1菌株的培养基配方以及培养条件进行优化，简化生产配方，降低生产成本，以期为产业化生产沼泽红假单胞菌R1菌剂提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌种
沼泽红假单胞菌R1：由河南省微生物工程重点实验室保藏。
1.1.2培养基
菌种保藏培养基(ATYP琼脂)：K2HPO41.0 g、CaCl20.1 g、NaHCO33.0 g、CH3COONa 1.0 g、MgCl20.5 g、NH4Cl 1.0 g、NaCl 1.0 g、微量元素溶液1.0 ml、维生素溶液1.0 ml、琥珀酸钠1.0 g、酵母抽提物0.5 g、蛋白胨0.5 g、琼脂12 g、蒸馏水1 000 ml，pH值6.8。
其中，微量元素溶液：FeCl2·4H2O 1.8 g、CoCl2·6H2O 0.25 g、NiCl2·6H2O 0.01 g、CuCl2·2H2O 0.01 g、MnCl2·4H2O 0.70 g、ZnCl20.1 g、H3BO30.5 g、Na2MoO4·2H2O 0.03 g、Na2SeO3·5H2O 0.01 g、蒸馏水1 000 ml。
维生素溶液：生物素0.1 g、烟酸0.35 g、盐酸硫胺素0.3 g、对氨基苯甲酸0.2 g、盐酸吡多胺0.1 g、泛酸钙0.1 g、维生素B120.05 g、蒸馏水1 000 ml。
基本培养基：K2HPO41.0 g、CaCl20.1 g、NaHCO33.0 g、CH3COONa 1.0 g、MgCl20.5 g、NH4Cl 1.0 g、Na-Cl 1.0 g、微量元素溶液1.0 ml、维生素溶液1.0 ml、琥珀酸钠1.0 g、酵母抽提物0.5 g、蛋白胨0.5 g、蒸馏水1 000 ml，pH值6.8。
双层平板计数培养基：NH4Cl 1.0 g、K2HPO40.2 g、CH3COONa 3.0 g、NaHCO31.0 g、酵母膏0.2 g、NaCl 1.0 g、MgCl20.20 g、T.M.储液1.5 ml、蒸馏水1 000 ml，pH值6.8。
其中T.M.储液：FeCl35.0 mg、CuSO4·5H2O 0.05 mg、H3BO31.0 mg、MnCl2·5H2O 0.05 mg、ZnSO4·7H2O 1.0 mg、Co(NO3)2·6H2O 0.5 mg、蒸馏水1 000 ml。
双层平板计数培养基中底层平板培养基添加0.8%琼脂，上层平板培养基添加1.0%琼脂。
1.1.3主要试剂
蛋白胨、酵母膏购自于北京奥博星生物技术有限公司；蔗糖、K2HPO4、NaHCO3、CH3COONa、（NH4）2SO4、NH4Cl、DL-苹果酸、柠檬酸、丁二酸钠、甘油、尿素等主要试剂均为分析纯。
1.1.4主要仪器
YQX-Ⅱ厌氧培养箱、T6新世纪紫外可见光分光光度计、PHSJ-3F酸度计、T8-1磁力搅拌器、SW-CT-ICU超净工作台、YP2102电子天平、LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅、101型电热鼓风干燥箱、DRP-9052型电热恒温培养箱。
1.2试验方法
1.2.1沼泽红假单胞菌液体菌种的制备
无菌操作条件下提取沼泽红假单胞菌R1菌种2～3环接入装有200 ml液体培养基的250 ml具塞磨口三角瓶中，30℃、40 W白炽灯距离20 cm处照射静置厌氧光照条件下培养14 d，用作沼泽红假单胞菌液体种子备用。
1.2.2沼泽红假单胞菌R1培养基优化试验
采用单因素试验设计，分别对沼泽红假单胞菌R1进行所需碳源试验。选择7种不同碳源（蔗糖、碳酸氢钠、乙酸钠、DL-苹果酸、柠檬酸、丁二酸钠、甘油）。所需氮源试验，选择5种不同氮源（蛋白胨、酵母膏、氯化铵、尿素、硫酸铵），然后根据发酵培养基碳源、氮源试验的试验结果，选择适宜碳源、适宜氮源、磷酸氢二钾为磷源、微量元素溶液、维生素溶液培养基成分作为5种因素，每个因素设计4个水平，设计正交试验L16（45）。每250 ml具塞磨口三角瓶中装有200 ml液体培养基，灭菌冷却后接入10.0 ml液体菌种，30℃、40 W白炽灯距离20 cm处照射厌氧光照条件下静置培养72 h，分析优化出沼泽红假单胞菌R1较佳的培养基配方。
1.2.3沼泽红假单胞菌R1培养条件试验
采用单因素试验设计，分别对沼泽红假单胞菌R1优化后的培养基进行接种量试验，按照体积比分别接入发酵培养基（2%、4%、6%、8%、10%）的液体种子；pH值试验，分别调整发酵培养基初始pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；装液量试验，250 ml具塞磨口三角瓶中分别装入液体培养基50、100、150、200 ml，灭菌冷却后接入体积比5%液体菌种；培养温度试验（25、30、35、40℃）；光照试验，分别选择不同白炽灯（25、40、60、100 W）距离20 cm处照射培养。接种量试验、pH值试验、培养温度试验、装液量试验、光照试验，每250 ml具塞磨口三角瓶中装有200 ml液体培养基，灭菌冷却后接入体积比5%，即10.0 ml液体菌种，白炽灯距离20 cm处厌氧光照条件下静置培养72 h，分析出沼泽红假单胞菌R1较佳的培养条件。
1.2.4生长量的测定
发酵培养液经充分振荡摇匀后，采用T6新世纪紫外可见分光光度计，以培养初期刚接入菌种的液体培养基为空白对照，于660 nm处测定发酵培养液OD660值。
沼泽红假单胞菌R1菌数含量的测定采用孙军德等（2001）光合细菌双层平板计数方法进行。
2结果与分析
2.1沼泽红假单胞菌R1发酵培养基的筛选
2.1.1不同碳源试验
ATYP琼脂培养基为基本培养基，氯化铵为供试氮源，磷酸氢二钾为磷源，加入1.0 g/l氯化铵、1.0 g/l磷酸氢二钾、1.0 ml/l微量元素溶液、1.0 ml/l维生素溶液，再分别加入1.0 g/l的蔗糖、碳酸氢钠、乙酸钠、DL-苹果酸、柠檬酸、丁二酸钠、甘油制作培养基，接种沼泽红假单胞菌R1培养7 d后，试验结果见图1。由图1可知，沼泽红假单胞菌R1较适宜的碳源为甘油。
2.1.2不同氮源试验
以甘油为碳源，磷酸氢二钾为磷源，加入1.0 ml/l微量元素溶液，1.0 ml/l维生素溶液，再分别加入蛋白胨、酵母膏、氯化铵、尿素、硫酸铵为唯一氮源配制培养基,接种沼泽红假单胞菌R1培养7 d后，试验结果见图2。由图2可知，沼泽红假单胞菌R1较适宜的氮源为酵母膏，其次为蛋白胨，但考虑到酵母膏、蛋白胨使生产成本高，营养丰富易造成染菌等因素，因此本试验选择氯化铵为氮源。
图1不同碳源对沼泽红假单胞菌R1生长的影响
图2不同氮源对沼泽红假单胞菌R1生长的影响
沼泽红假单胞菌R1菌株的培养基配方、培养条件、生长量及影响因素（一）
沼泽红假单胞菌R1菌株的培养基配方、培养条件、生长量及影响因素（二）