林氏扇头蜱抗菌肽重组蛋白对大肠埃希菌生长曲线影响及抑菌效果（三）
2结果
2.1基因克隆鉴定及重组质粒构建与鉴定
以林氏扇头蜱的cDNA为模版进行序列扩增，得到与预期大小相符约333 bp的目的条带（图1A），对特异性条带进行胶回收，测序后验证为目的基因。
图1 Microplusin-like基因扩增、双酶切和重组蛋白的表达结果注：A.Microplusin-like基因扩增，M.DL2000 marker，1.Microplusin-like PCR产物；B.双酶切结果，M.DL5000 marker，1.pCold-SUMO；2.pCold-SUMO/Microplusin-like；C.SDS-PAGE结果，M.14.4~116 kDa protein marker，1.pCold-SUMO空载未诱导，2.pCold-SUMO空载诱导，3.重组载体未诱导，4.重组载体诱导，5.重组载体表达沉淀，6.重组载体表达上清，7.纯化后的重组蛋白；D.Western Blot结果，M.10~250 kDa蛋白marker，1.空载体诱导，2.重组载体诱导，3.纯化后的重组蛋白。
2.2生物信息学分析
该序列由110个氨基酸组成，CAMPR3预测得分（SVM=1.0，RF=0.991）均>0.5，表明其具有潜在抑菌活性；净电荷数为-5.25，等电点（isoelectric point，PI）为5.29，判断其属阴离子；GRAVY值为-0.016，表明其可能具备一定亲水性以溶于液体，为后续发挥抗菌作用奠定基础；Wimley-White为27.31，表明其可能通过疏水作用破坏细菌膜结构；Boman index为1.33，表明该序列在理论上具有较好的抗菌潜力，可能具备有效的抗菌机制。
2.3重组质粒构建、原核表达及纯化鉴定
双酶切结果显示，在约5 000 bp和333 bp处各有一条与预期大小一致的目的条带（图1B），重组质粒可用于蛋白表达。SDS-PAGE结果显示，pCold-SUMO/Microplusin-like蛋白分子量约为29 kDa（图1C），与预期相符。Western Blot结果显示，在约29 kDa处出现目的条带（图1D），说明重组蛋白的His标签被对应的抗体识别。
2.4重组蛋白抑菌功能研究
2.4.1抑菌活性分析
重组蛋白对5株大肠埃希菌及1株沙门菌均表现出抗菌活性（图2），其中对E.coli ATCC25922、E.coli K88的抑菌圈直径均大于10 mm，表现出中度敏感，对E.coli 1515、E.coli 987P、E.coli K99、Salmonella pullorum CVCC 1791的抑菌圈直径大于16 mm，表现出高度敏感，对S.aureus CVCC 1882、S.aureus ATCC 43300未出现抑制效果；卡那霉素阳性对照组抑菌圈直径均大于16 mm，表现出高度敏感，空白对照组和阴性对照组未观察到抑菌圈出现，该重组蛋白对革兰阴性菌均具有一定抑制效果，对革兰阳性菌无抑制作用。见表1。
图2 Microplusin-like的抑菌圈试验结果注：A1~A4依次为:E.coli ATCC 25922阳性对照、阴性对照、空白对照、Microplusin-like；B1~B4依次为Salmonella pullorum CVCC 1791阳性对照、阴性对照、空白对照、Microplusin-like；C.E.coli 1515；D.E.coli 987P；E.E.coli K88；F.E.coli K99；G.S.aureus CVCC 1882；H.S.aureus ATCC4 3300；C~H.红色箭头为Microplusin-like，绿色箭头为阴性对照，蓝色箭头为空白对照，黄色箭头为阳性对照。
表1 Microplusin-like的抑菌圈直径mm
注：-.无抑菌圈；同一列不同小写字母表示差异有统计学意义（P<0.05）。
2.4.2最低抑菌浓度及最低杀菌浓度测定
对各供试菌株的MIC及MBC结果表明，重组蛋白对大肠埃希菌及沙门菌具有较高的抑菌活性，除E.coli K88外，最小抑菌浓度均在0.625 mg/mL，但其杀菌活性相对较弱，部分菌株的MBC值超过5 mg/mL，达到了MIC的8倍（表2）。
表2 Microplusin-like的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度mg/mL