携带抗生素耐药基因沙门菌P1噬菌体-质粒效价、形态、一步生长曲线及最适温度（一）
摘要
P1噬菌体-质粒作为肠杆菌科细菌抗生素耐药基因的载体受到人们的关注，本研究旨在探究携带抗生素耐药基因的P1噬菌体-质粒是否具有诱导和进一步转导等生物学特性问题。对沙门菌中携带耐第三代头孢菌素类耐药基因blaCTX-M-27的P1噬菌体-质粒(命名为P1-CTX)的生物学特性进行研究，包括噬菌体效价、最佳感染复数、一步生长曲线、温度和酸碱稳定性等。结果显示，P1-CTX噬菌体-质粒可诱导产生有裂解能力的完整噬菌体，效价为106 PFU·mL-1，最佳感染复数为0.01；P1-CTX噬菌体在低于50℃环境下活力较好，耐强碱而不耐强酸。可感染沙门菌和大肠埃希菌，且在宿主菌中不产生适应代价，稳定性较好。综上表明，P1-CTX噬菌体-质粒具有正常的噬菌体生物学特性，可携带耐药基因通过转导的方式水平传播，且稳定性好。
近年来，由于耐药基因在世界各地细菌间爆炸性传播，耐药病原体对临床细菌性疾病的治疗带来了巨大的挑战。溶原性噬菌体作为细菌基因组的一部分存在于宿主细菌中，占其基因组的20%，噬菌体诱导后可产生大量噬菌体粒子，并携带宿主基因进行高频基因转移，它们在调节细菌种群和介导水平基因转移中起到了核心作用。P1噬菌体属于温和广义性转导噬菌体，是分子生物学的重要工具。与大多数已知的存在于细菌染色体中的溶原性噬菌体不同，P1噬菌体以环形质粒的形式游离存在于细菌宿主中，且近期的研究显示，P1噬菌体作为肠杆菌耐药基因的载体，或可融合部分质粒片段，又称为P1噬菌体-质粒(phage-plasmids，PPs)。有研究报道，大肠埃希菌中P1噬菌体-质粒携带mcr-1、blaSHV-2、blaCTX-M-55、blaTEM-1b或blaCTX-M-15等耐药基因以质粒形式存在但失去噬菌体活性无法进一步转导。本课题组前期从屠宰场猪肉分离的沙门菌中，首次发现携带Tn1721-blaCTX-M-27转座子的P1噬菌体-质粒介导沙门菌对三代头孢菌素类抗生素高水平耐药。此外，最近的研究也报道了肉源沙门菌中相同P1噬菌体-质粒。但其是否还具备噬菌体活性并通过转导的形式进一步传播耐药基因尚不清楚。且P1噬菌体-质粒在宿主细胞中从沉默的质粒状态到噬菌体粒子形成是一个多步骤的过程，而仅从噬菌体基因组角度分析，很难判定其能否具有产生噬菌体粒子的能力。因此，本研究主要对携带Tn1721-blaCTX-M-27的P1噬菌体-质粒(命名为P1-CTX噬菌体-质粒)进行诱导，检测其噬菌体效价，研究P1-CTX噬菌体-质粒形态、最佳感染复数、稳定性以及对宿主的影响等方面，旨在评估携带耐药基因溶源噬菌体P1在肠杆菌间传播耐药基因的可能，为噬菌体促进细菌间抗生素耐药基因扩散的重大影响提供理论支持。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株来源
P1-CTX噬菌体-质粒宿主沙门菌J46以及P1-CTX噬菌体-质粒转导及裂解受体菌为实验室前期分离保存。
1.1.2主要试剂
LB固体琼脂培养基、LB肉汤培养基、水解酪蛋白琼脂培养基、水解酪蛋白肉汤培养基、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂，广州环凯微生物有限公司产品；2×DNA PCR Master Mix、DNA Marker DL 2 000、6×Loading Buffer，宝生物工程(大连)有限公司产品。
1.1.3主要仪器
DNP-9272型电热恒温培养箱为上海申贤恒温设备厂产品；超净工作台为苏州净化设备有限公司产品；PCR扩增仪为美国BIO-RAD公司产品；Talos F200S型场发射透射电子显微镜为美国FEI公司产品。
1.2方法
1.2.1 P1-CTX噬菌体-质粒效价测定
取OD600=0.5、1.0、1.5的沙门菌J46，加入丝裂霉素C(mitomycin C，MitC)至终浓度为2μg·mL－1，分别在26℃、32℃、37℃、42℃振荡培养，取1、2、4、6、20 h诱导液，13 000 r·min-1离心5 min，0.22μm孔径过滤器过滤上清回收含噬菌体滤液。
OD600=0.5受体菌沙门菌BYC4与噬菌体1∶1充分混匀，使噬菌体与受体菌表面充分吸附。双层琼脂法计算噬菌体数量。每组试验重复3次。噬菌体效价=平均值×10×稀释倍数。
1.2.2 P1-CTX噬菌体-质粒透射电镜观察形态
将噬菌体悬浮液滴到膜上，将铜网正面向上放入到噬菌体悬浮液中，静置15 min后，取出铜网。醋酸双氧铀(1%，pH=7)印迹并负染。将已准备好的样品置于60 kV条件下用场发射透射电子显微镜进行检测。
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