携带抗生素耐药基因沙门菌P1噬菌体-质粒效价、形态、一步生长曲线及最适温度（二）
1.2.3 P1-CTX噬菌体-质粒最佳感染复数测定
感染复数(multiplicity of infection，MOI)=噬菌体数量(plaque forming unit，PFU)/宿主菌数量(colony forming units，CFU)。不同MOI的效价最高时，即为最佳感染复数。受体菌沙门菌BYC4分别按照MOI值为：10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10混匀，37℃振荡培养4 h，过滤器除菌后将噬菌体10倍稀释后，噬菌斑法测定噬菌体效价，每组试验3个平行。
1.2.4 P1-CTX噬菌体-质粒一步生长曲线测定
噬菌体和受体沙门菌BYC4，按照最佳感染复数混匀。参照屈平平的研究，方法略有改动。每隔15 min取100μL，梯度稀释后噬菌体斑法测定其效价，每组试验3个平行。感染时间为X轴，噬菌体效价的log值为Y轴，绘一步生长曲线图。爆发量为裂解末期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度。
1.2.5 P1-CTX噬菌体-质粒最适生长温度测定
P1-CTX噬菌体-质粒分别于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴，分别在30、60和90 min各取3管，稀释后测其效价。
1.2.6 P1-CTX噬菌体-质粒pH稳定性测定
P1-CTX噬菌体-质粒分别加入900μL不同pH(2~13)的SM Buffer，37℃室温静置，分别30、60和90 min各取3管样品，稀释后测其效价。
1.2.7 P1-CTX噬菌体-质粒转导及宿主适应性测定
沙门菌或大肠埃希菌受体菌与噬菌体混合，涂布于含CTX 1 mg·L-1的LB固体培养基平板上。PCR的方法验证头孢噻肟琼脂培养基上转导菌株。
转导成功的大肠埃希菌和沙门菌及其原菌37℃连续培养12 h。使用酶标仪每隔2 h测定600 nm吸收光下细菌浓度变化。每组实验设置3个平行计数。
1.2.8 P1-CTX噬菌体-质粒稳定性测定
转导成功的大肠埃希菌和沙门菌及其原菌37℃连续培养24 h。1∶1 000连续重复传代30 d。每组试验设置3个平行计数。
1.2.9数据统计
利用GraphPad prism 5对数据进行处理分析。
2结果
2.1 P1-CTX噬菌体-质粒效价
为评估沙门菌J46中P1噬菌体-质粒能否被诱导并释放出感染子代颗粒，选用噬菌体诱导剂丝裂霉素C，在时间维度上不同温度条件下进行研究。选取对数期OD600=0.5沙门菌J46四种不同温度26℃、32℃、37℃、42℃分别连续诱导20 h。结果显示，不同温度均可产生感染噬菌体颗粒(图1)。其中，温度为37℃和42℃时，诱导时间1 h即有噬菌体产生，诱导时间在4~6 h，噬菌体效价最高，可达约106 PFU·mL-1，随着时间的延长，噬菌体效价缓慢下降。温度为26℃和32℃时，诱导时间6 h时可观察到噬菌体产生，当诱导时间延长到20 h时，其效价仍低于37℃时诱导的最佳效价。
图1 P1-CTX噬菌体-质粒效价
2.2 P1-CTX噬菌体-质粒形态
沙门菌J46中可诱导P1-CTX噬菌体-质粒，由噬菌斑照片可知，P1-CTX产生的裂解斑块直径为1~2 mm，且清晰(图2A)。P1-CTX噬菌体-质粒属于肌病毒科，透射电镜下可观察到P1-CTX由头部和尾部组成，头部为球状直径约60~80 nm。尾部约为120~160 nm，且与头部相连的尾部有髓鞘包裹，尾部可清晰地观察到中空的尾管结构，与已公布的标准P1噬菌体一致(图2B)。
A.P1-CTX噬菌斑；B.透射电子显微镜下P1-CTX噬菌体形态
图2 P1-CTX噬菌体-质粒噬菌斑和电镜下形态
2.3 P1-CTX噬菌体-质粒最佳感染复数MOI
为检测噬菌体P1最佳感染复数，噬菌体和受体菌共培养后通过噬菌斑计数试验检测。结果如表1所示，当P1-CT噬菌体-质粒和受体菌比例为0.01时，为最佳感染复数，可产生最多的噬菌体子代，噬菌体效价为1.97×108 PFU·mL-1。随着MOI值的降低，噬菌体效价值呈现明显下降，而随着MOI值的增大，噬菌体效价变化幅度较小，均维持在108 PFU·mL-1水平。
表1 P1-CTX噬菌体-质粒最佳感染复数
2.4 P1-CTX噬菌体-质粒一步生长曲线
噬菌体的裂解周期，其增殖过程包括五个阶段，分别为吸附、核酸注入、DNA合成、噬菌体粒子组装和裂解细胞释放。噬菌体的吸附、增殖和裂解可用一步生长曲线描述。由图3可以看出，P1-CTX噬菌体-质粒从吸附到裂解释放出噬菌体颗粒的潜伏期为45 min，从检测出噬菌体到噬菌体数量达到顶值，裂解期持续约50 min，约100 min后达到平台期，裂解末期噬菌体数量约为1.0×108 PFU·mL-1，P1噬菌体的裂解量为63 PFU·cell-1。
图3 P1-CTX噬菌体-质粒一步生长曲线
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