苯乳酸对霍氏肠杆菌生长曲线、细胞凋亡、抑制活性、DNA的影响（三）
2 结果与分析
2.1 苯乳酸对霍氏肠杆菌抑制活性的测定
MIC 是评价物质抑菌能力的主要指标之一。由表1 可知，当苯乳酸的稀释的质量浓度最小达到1.25 mg/mL 时，不同培养温度下96 孔板中均无菌生长，因此确定苯乳酸对霍氏肠杆菌的MIC为1.25 mg/mL。当苯乳酸质量浓度为1.25 mg/mL时，继续在LB 营养琼脂培养基平板培养24 h 上仍有少量菌落，而当质量浓度升至2.5 mg/mL 时无菌落生长，因此确定MBC 为2.5 mg/mL。结果表明，较低质量浓度的苯乳酸可抑制霍氏肠杆菌的生长，且存在质量浓度依赖性。有文献报道苯乳酸对大肠杆菌O157：H7（E.coli O157：H7）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）的MIC 分别是1.25，1.25，1.5和2.5 mg/mL，说明苯乳酸对霍氏肠杆菌的抑菌活性高于金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌，而与大肠杆菌O157：H7 和荧光假单胞菌基本相同。
表1 不同温度下苯乳酸对霍氏肠杆菌的MIC 测定结果
注：“+”表示观察到细菌明显生长，“—”表示细菌无明显生长。
2.2 苯乳酸对霍氏肠杆菌的生长抑制作用
微生物生长曲线能有效反映微生物数量随时间变化。由28 ℃培养下霍氏肠杆菌的生长曲线可知（图1a），本试验中对照组霍氏肠杆菌在5 h 时开始进入对数生长期，而加入1/2 MIC 苯乳酸后其进入对数生长期时间延后1 h。在培养过程中，1/2 MIC 组OD 值相较于对照组偏小，而最终进入稳定期时与对照组最大生物量基本一致，说明该质量浓度下的苯乳酸无法完全抑制霍氏肠杆菌的生长能力。图1b 显示37 ℃培养下的生长曲线在3 h 时开始进入对数生长期，在整个培养过程中，1/2 MIC 的OD 值一直小于对照组。然而，2 个培养温度下MIC 与2 MIC 组中，OD 值在整个培养过程中未增加，表明此时霍氏肠杆菌的生长被完全抑制。37 ℃培养的霍氏肠杆菌较28 ℃培养能更快速进入对数生长期及稳定期，生长速率更快，而最大生物量无显著差异。
图1 苯乳酸对霍氏肠杆菌生长曲线的影响
2.3 苯乳酸对霍氏肠杆菌细胞凋亡的影响
碘化丙啶（PI）可以透过死亡或破损的细胞对DNA 进行染色，通过流式细胞仪检测苯乳酸对霍氏肠杆菌细胞凋亡的影响。流式细胞图的4 个区域分别为存活细胞（左下）、早期凋亡（右下）、晚期凋亡（右上）和细胞坏死（左上）。由图2 可知，在28 ℃培养振荡培养24 h，对照、1/2 MIC、MIC、2 MIC 组的细胞存活率分别为94.6%，93.7%，90.2%，81.8%，在37 ℃培养下，对照、1/2 MIC、MIC、2 MIC 的细胞存活率分别为93.3%，88.7%，90.0%，80.1%，表明苯乳酸1/2 MIC 和MIC 处理不会显著导致细胞凋亡和坏死，而在2 MIC 处理时，细胞坏死率分别达到11.4%和11.8%，说明高质量浓度下的苯乳酸会显著造成细胞坏死。在28℃和37 ℃培养下的苯乳酸对菌的生长曲线和细胞凋亡率没有明显差异，因此以28 ℃为培养条件进行下列抗菌机制的研究。
图2 苯乳酸对霍氏肠杆菌细胞凋亡的影响
2.4 苯乳酸对霍氏肠杆菌细胞结构完整性的影响
细胞壁和细胞膜作为细胞重要的结构，其完整性在维持细胞正常生长中至关重要，也是许多抑菌物质的重要靶点。碱性磷酸酶（AKP）位于细胞壁和细胞膜之间，当细胞壁受损时，AKP 会泄漏到细菌细胞外介质中，造成胞内酶含量降低，常用于反应细胞壁完整性的变化。由图3a 可知，AKP酶活力随着时间和苯乳酸质量浓度的增加而显著减少（P ＜0.05），在48 h，2 MIC 时降至最低。结果表明，苯乳酸在一定程度上破坏了霍氏肠杆菌的细胞壁，并且受到作用时间和苯乳酸质量浓度的影响。
图3 苯乳酸对霍氏肠杆菌细胞结构完整性的影响
注：不同小写字母表示组间差异显著（P＜0.05）。
通过测定二乙酸荧光素（FDA）的荧光强度可以反映细胞膜完整性的变化。只有活细胞根据酶活性可将非荧光FDA 主动转化为绿色荧光化合物，当细胞膜完整时，可以在细胞内检测出FDA荧光，而当细胞膜遭到破坏，FDA 会从细胞内流出，无法被检测到。如图3b 所示，1/2 MIC、MIC、2 MIC 处理组荧光强度相较于对照组显著降低（P＜0.05），且苯乳酸质量浓度越高，荧光强度下降幅度越大。2 MIC 组荧光强度约是对照组的1/2 倍，表明此质量浓度下细胞膜被破坏的程度最严重。试验结果表明苯乳酸有效的破坏了细胞膜的完整性。
当细胞膜的完整性被破坏时，离子首先流出，然后是核酸和蛋白质等大分子物质。因此，通过测定在波长260 nm 与280 nm 波长处的吸光度来确定细胞中核酸与蛋白质等胞内物质的泄漏情况。由图3c 可知，在波长260 nm 处胞外吸光值随着苯乳酸处理质量浓度的增加而增加，且随着处理时间延长而增加。在48 h，经2 MIC 苯乳酸处理后的吸光度达到最高，约是处理组的1.6 倍，表明苯乳酸处理导致霍氏肠杆菌核酸的泄漏。由图3d 可知，MIC 苯乳酸组在波长280 nm 处的胞外吸光值显著高于对照组（P ＜0.05），且随着处理时间延长而显著增加，说明苯乳酸处理导致霍氏肠杆菌蛋白质的泄漏。值得注意的是，1/2 MIC 组吸光值与对照组相比差异不显著，而2 MIC 组吸光值呈现了下降的趋势，其原因可能是随着苯乳酸处理质量浓度的增加，溶液酸度升高，pH 值改变引起上清液中的部分蛋白质发生沉降而导致含量降低。结果表明，苯乳酸处理破坏了霍氏肠杆菌细胞膜完整性，导致核酸与蛋白质等物质的泄漏，从而影响细胞的正常生理活动。
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