基于细菌生长曲线测定探究具核梭杆菌促进肺癌发展的潜在机制（三）
2.2具核梭杆菌促进小鼠肺癌转移
采用C57小鼠进行尾静脉注射造模实验，通过肺部递送2种具核梭杆菌或PBS(图2A)。造模成功后收集3组小鼠的肺组织，并使用IVIS Spectrum系统进行拍照(图2B)。结果显示，Fn-9组和Fn-ATCC组肺组织的荧光强度显著高于PBS组(图2C)。统计肺结节数量发现，Fn-9组和Fn-ATCC组的数量显著高于对照组(图2D)。同时，2组的肺器官系数也均高于PBS组(图2E)。这些结果表明，具核梭杆菌可能促进了肿瘤细胞的增殖与转移。
图2具核梭杆菌促进小鼠肺癌转移。A：实验流程图；B、C：Fn-9、Fn-ATCC和PBS 3组荧光强度比较；D、E：3组肺结节数量和肺器官系数。
为了进一步了解3组小鼠的肺损伤情况，对肺切片进行了HE染色分析。病理结果显示，3组小鼠的肺部均有炎症细胞浸润，但Fn-9组和Fn-ATCC组的肺泡间隔破坏更为严重，部分气道黏膜上皮也出现萎缩(图3A)。值得注意的是，2组的肺肿瘤面积明显增大，肺结节数量明显增多(图3A)。同样地，qPCR检测3组小鼠肺组织中炎症因子的表达发现，Fn-9组和Fn-ATCC组的IL-1β和TNF-α表达量更高(图3B、3C)，而IL-6的表达在3组之间无显著差异(图3D)。综上所述，在动物水平上证明了具核梭杆菌促进了肺癌的转移和进展。
图3病理切片图和定量聚合酶链反应(qPCR)。A：Fn-9、Fn-ATCC和PBS 3组肺组织切片；B-D：IL-1β、TNF-α和IL-6在小鼠肺组织中的表达(ns：无统计学意义；*：
2.3具核梭杆菌对小鼠肺部微生物群的影响
收集上述各组及正常小鼠的肺泡灌洗液，探讨具核梭杆菌对肺微生物群的影响。在属水平，Fn-9组和Fn-ATCC组细菌组成明显不同于PBS组(图4A)。Chao1指数表明，Fn-9组的α多样性显著高于空白组(图4B)。然而，4组间的β多样性无显著差异(图4C)。MetagenomeSeq分析显示，Fn-9组和Fn-ATCC组中Muribaculum的丰度显著低于PBS组，而Fn-9组中Simplicispira的丰度显著高于PBS组(图4D)。
图4具核梭杆菌对肺部微生物群的影响。A：4组菌属水平前20个丰度的群落条形图；B：4组肺泡灌洗液的Chao1指数(P值通过Kruskal-Wallis检验计算，*：P<0.05)；C：4组肺泡灌洗液的PCoA图(ANOSIM用于统计评估显著差异)；D：MetagenomeSeq检测4组之间的差异物种(*：P<0.05)。
2.4肺组织转录组分析
转录组测序用于描述肺组织变化的特征。主成分分析(principal components analysis,PCA)结果显示，Fn-9组、Fn-ATCC组和PBS组的转录组基因存在显著差异(图5A)。进一步通过火山图比较其差异基因的变化，发现与PBS组相比，Fn-ATCC组共有1 855个差异基因表达上调，1 185个差异基因表达下调(图5B)；而在Fn-9组与PBS组的比较中，Fn-9组共有864个差异基因表达上调，640个差异基因表达下调(图5C)。随后，分析了3组小鼠肺组织中KEGG通路差异基因的富集情况。在Fn-9组、Fn-ATCC组和PBS组的比较中，差异基因主要富集在IL-17信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞周期和运动蛋白等信号通路上，这提示Fn-9组和Fn-ATCC组2种菌株可能通过调节免疫反应来促进肺癌的进展(图5D、5E)。
图5感染后肺癌组织的转录组。A：3组样本间的主成分分析；B、C：差异基因表达分析的火山图；D：Fn-ATCC与PBS之间RNA-seq数据中差异基因的KEGG通路富集分析；E：Fn-9与PBS之间RNA-seq数据中差异基因的KEGG通路富集分析。
3讨论与结论
传统上，肺一直被认为是一个无菌器官，随着分子测序技术的发展证实肺中实际上存在少量微生物，这可能是由于口腔、上呼吸道、下呼吸道和肺直接接触导致呼吸道或口腔中的微生物进入呼吸道并在肺中定殖[12-14]。根据目前的理论，大多数微生物通过上呼吸道以及微量吸入的方式进入肺部[14-16]。相比之下，某些微生物已被证实会增加患肺癌的风险[17]。作为口腔中常见的条件致病菌，具核梭杆菌已被证明与多种疾病相关[18-20]。具核梭杆菌与牙龈卟啉单胞菌协同作用可诱发牙周炎，并促进口腔癌的发展[4,21-22]。除口腔疾病外，研究人员还在结直肠癌患者的组织中检测到高丰度的具核梭杆菌[23-24]，并进一步证实具核梭杆菌对结直肠癌有促进作用[6,25]。从作用机制上看，具核梭杆菌能激活Apcmin/+小鼠的NF-κB信号通路，并诱导TNF、IL-6、IL-8和IL-1β等促癌通路[8,26]。然而，目前尚无直接证据表明具核梭杆菌与肺癌有关。
本研究首先选择了2种不同来源的具核梭杆菌菌株：一种是ATCC 25586标准菌株，另一种是从肺癌患者肺泡灌洗液中提取的具核梭杆菌动物亚种。与其他亚种相比，动物亚种具核梭杆菌在结直肠癌生态区域中占主导地位[27]。在动物实验中，发现向小鼠肺部递送具核梭杆菌可促进肺结节数量的增加，并且实验组的肺组织在荧光成像下比对照组的荧光强度更强。通过qPCR检测发现，小鼠肺组织中TNF-α和IL-1β基因的表达显著增加。研究也表明，TNF-α在肺癌的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、侵袭、转移和进展过程中起着重要作用，这在TNFR2-KO小鼠植入Lewis肺癌(LLC)模型中也得到了证实[28-29]。IL-1β也被证实在肿瘤微环境中的表达升高，并在肺癌的转移发展中发挥重要作用[30-31]。
根据肺泡灌洗液的16S rRNA基因测序结果，在实验组和PBS组之间发现了2个不同的属：简单螺旋形菌属(Simplicispira)和鼠杆状菌属(Muribaculum)。简单螺旋形菌属是一种常见于土壤、水库和污泥中的细菌，尚未见与癌症相关的报道[32-33]。鼠杆状菌属与肠道微生物群中的脂质代谢以及结直肠癌中的肠道微生物菌群失调有关[34-35]。肺组织转录组KEGG结果表明，具核梭杆菌可能通过免疫相关信号通路促进肺癌转移。细胞因子-细胞因子受体相互作用通路与肿瘤密切相关，研究证实齐墩果酸可通过调节细胞因子-细胞因子受体相互作用通路来调控乳酸菌抑制肿瘤的发展，TRIM6也通过该通路促进胶质瘤的发展[36-37]。同样地，TNF信号通路也参与了细胞凋亡及其对癌症疾病的影响[38-39]。具核梭杆菌进入小鼠肺部后，激活了金黄色葡萄球菌感染途径，而金黄色葡萄球菌具有很强的促炎能力，能引起肺炎等疾病[40-41]。肺部炎症会诱发肺部微环境的改变，从而导致肺癌病变[42]。此外，尽管在结直肠癌研究中已显示具核梭杆菌能够进入肠上皮细胞发挥作用，但对于具核梭杆菌是否能进入肺上皮细胞尚无相关报道，这也是后续机制研究的方向之一。
综上所述，通过细胞实验验证了具核梭杆菌能促进A549细胞的增殖和转移，并通过体内实验进一步验证了它能促进肺癌的转移和恶化。根据16S rRNA基因测序结果和肺组织转录组结果，具核梭杆菌进入小鼠肺部后扰乱了肺部菌群的组成，激活了肺组织中多个与炎症和免疫相关的信号通路，这可能是具核梭杆菌促进肺癌的潜在机制。
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