基于微生物生长曲线监测系统探究肺炎克雷伯菌菌株毒力与碳青霉烯类耐药性的关系（二）
1材料与方法
1.1菌株来源、仪器及试剂
收集2016—2019年四川大学华西医院血流感染患者血培养分离的192株非重复肺炎克雷伯菌，其中96株为CRKP，96株为CSKP。
微生物生长曲线监测系统为丹麦Biosense公司产品；PCR仪器为美国Bio-Rad公司产品；Illumina HiSeq X10测序平台为美国Illumina公司产品；培养基为郑州安图生物工程股份限公司产品；DNA提取试剂盒为德国Qiagen公司产品。
大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853和金黄色葡萄球菌ATCC25923为药敏试验质控菌株；肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705（blaKPC阳性）、肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706（碳青霉烯酶基因阴性）和肺炎克雷伯菌ATCCBAA-2146（blaNDM阳性）为PCR质控菌株。
1.2全自动微生物分析仪检测抗菌药物敏感性
通过丹麦Biosense微生物生长曲线监测系统对菌株进行药敏试验，根据临床实验室标准协会指南（CLSI-M100）对最低抑菌浓度值进行判读。
1.3 PCR检测碳青霉烯酶基因
通过PCR检测五种常见的碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaOXA），对纯化符合预期大小的PCR产物进行测序验证。
1.4拉丝实验结合PCR检测鉴定菌株的高黏表型、毒力基因和荚膜分型
采用拉丝实验鉴定高黏表型。使用标准接种环挑取单个菌落，拉丝在5 mm及以上视为菌株具有高黏表型。通过PCR检测6种荚膜血清型（K1、K2、K5、K20、K54、K57）和magA、allS、rmpA、mrkD、fimH、Kfu、entB、ybtS、铁载体需氧菌素（aerobictin）和iutA等10种毒力基因。将携带rmpA和iutA基因同时具有高黏表型的菌株定义为HVKP。
1.5全基因组测序检测CR-HVKP的基因组特征
采用DNA提取试剂盒提取CR-HVKP菌株的基因组DNA，通过Illumina HiSeq X10平台进行基因组测序，使用Sickle（GitHub）和SPAdes 3.8软件修剪并组装基因组，再通过Institut Pasteur、ResFinder和Pasteur等数据库分别对CR-HVKP菌株的MLST、耐药基因和毒力基因进行比对鉴定。
1.6生物膜形成试验检测菌株的生物膜形成能力
通过生物膜形成试验检测CR-HVKP菌株的毒力。选取6株肺炎克雷伯菌（不携带碳青霉烯酶基因CRKP、CSKP、携带碳青霉烯酶基因CRKP、CS-HVKP、CR-HVKP、标准菌株ATCC700603），以无菌LB肉汤作为空白对照测定菌株的生物膜形成。根据吸光度值将菌株生物膜形成能力分为弱（吸光度值≤0.4）、中（吸光度值>0.4~0.6）、强（吸光度值>0.6）。
1.7血清抗性实验检测CR-HVKP菌株对血清抗体的反应
采用血清抗性实验验证CR-HVKP的毒力。选取6株肺炎克雷伯菌（不携带碳青霉烯酶基因CRKP、CSKP、携带碳青霉烯酶基因CRKP、CS-HVKP、CR-HVKP、标准菌株ATCC700603）与人正常血清混合，观察活菌数。根据活菌数将血清抗性的反应分为六个等级：血清敏感（1或2级）、中度敏感（3或4级）和血清抵抗（5或6级）。
1.8统计学方法
采用WHONET和SPSS 22.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（¯x±s）描述。计数数据以百分比（%）描述，组间比较采用χ2检验，当n<5时，使用Fisher精确检验。P<0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism软件绘图。
2结果
2.1不同耐药表型菌株对常见抗菌药物的耐药性比较
96株CRKP和96株CSKP对常见抗菌药物的耐药性见表1。CRKP对头孢类、酶抑制剂类和碳青霉烯类药物耐药率均在90%以上，对氨基糖苷类耐药率相对较低；CSKP则对头孢类、酶抑制剂类、氨基糖苷类和碳青霉烯类药物保持较好的敏感性。除米诺环素外，两组菌株对常见抗菌药物的耐药率差异均有统计学意义（均P<0.05）。结果提示，CRKP对抗菌药物耐药率明显高于CSKP。
表1碳青霉烯类敏感和耐药肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率比较
与CSKP比较，*P<0.05，**P<0.01.CSKP：碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌；CRKP：碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌.
2.2不同耐药表型菌株碳青霉烯酶基因检测结果
96株CRKP中，检出碳青霉烯酶基因92株，其中77株（83.7%）仅检出blaKPC-2，11株（12.0%）仅检出blaNDM-5，4株（4.3%）同时检出两种基因（2株同时检出blaKPC-2和blaNDM-1，2株同时检出blaKPC-2和blaNDM-5）。96株CSKP均未检出碳青霉烯酶基因。结果提示，CRKP菌株对碳青霉烯类药物耐药的主要机制是产碳青霉烯酶，以blaKPC-2基因为主。
2.3不同耐药表型菌株高黏表型、毒力基因和荚膜分型检测结果
经检测，CRKP中4株（4.2%）具有高黏表型，而CSKP中36株（37.5%）具有高黏表型，两者高黏表型差异具有统计学意义（P<0.01）。
96株CRKP中，检出荚膜抗原3株（3.1%），均为携带K57。96株CSKP中，检出荚膜抗原37株，其中20株（20.8%）携带K1，13株（13.5%）携带K2，2株（2.1%）携带K5，1株（1.0%）携带K20，1株（1.0%）携带K54。CRKP和CSKP中entB、mrkD和fimH基因检出率均超过90.0%，两组间差异无统计学意义。Kfu、aerobictin、iutA、ybtS、rmpA、magA、allS以及荚膜抗原K1和K2在CSKP的检出率均高于CRKP（均P<0.01）。见表2。CRKP与CSKP携带的毒力基因种类亦存在差异：CRKP中87.5%携带3种毒力基因，6.3%携带4种毒力基因；而CSKP中33.3%携带3种毒力基因，17.7%携带10种毒力基因，13.5%携带7种毒力基因。根据1.4中HVKP的定义，CRKP中1株为HVKP（CR-HVKP），CSKP中36株为HVKP，两者HVKP比例差异具有统计学意义（P<0.01）。结果提示CRKP毒力基因携带率低于CSKP。
表2碳青霉烯类敏感和耐药肺炎克雷伯菌毒力基因或荚膜抗原检出情况比较
—：无相关资料.CSKP：碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌；CRKP：碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌；entB：铁载体肠杆菌素；mrkD：黏附因子3型菌毛基因；fimH：黏附因子1型菌毛基因；aerobictin：铁载体需氧菌素；rmpA：黏液样表型A调节基因；iutA：铁载体气杆菌素；ybtS：铁载体耶尔森杆菌素；Kfu：克雷伯菌铁摄取蛋白；allS：尿囊素代谢基因；magA：黏液相关基因A.