鸭瘟病毒基因缺失株rDEV-ΔVP26生长曲线、蚀斑面积及免疫原性分析（一）
摘要
为研究鸭瘟病毒(duck enteritis virus，DEV)UL35基因缺失DEV疫苗株的生物学特性和对强毒株攻击的免疫保护效果，本研究在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆pDEV-EF1基础上，通过“Red E/T两步重组”技术，构建了UL35基因缺失的pDEV-ΔVP26突变体克隆，并转染鸡胚成纤维细胞(CEFs)获得了重组病毒rDEV-ΔVP26，进而对重组病毒细胞生物学特性和免疫保护能力进行了评估。病毒一步生长曲线测定表明，rDEV-ΔVP26的滴度从24~84 h稳步上升，达到峰值105.36 TCID50·0.1 mL-1。在此期间，rDEV-ΔVP26滴度较亲本毒株rDEV-EF1相比有所降低。蚀斑面积测定发现rDEV-ΔVP26蚀斑面积较亲本株rDEV-EF1减少了10.60%，说明UL35基因缺失会轻微影响病毒扩散并降低病毒滴度。动物试验表明，1×106 TCID50的rDEV-ΔVP26对30日龄麻鸭无致病作用，且1×105 TCID50滴度的rDEV-ΔVP26免疫组在强毒株攻击下的保护率与相同剂量的rDEV-EF1对照组一致。该研究表明，UL35为DEV复制非必需基因，且当接种合适剂量的病毒液时，UL35缺失不影响鸭瘟病毒疫苗株的免疫保护效果。该研究为研发用于区分疫苗免疫和野毒感染的DEV鉴别诊断疫苗奠定了基础。
鸭瘟病毒(duck enteritis virus，DEV)，又称鸭疱疹病毒Ⅰ型(Anatid alphaherpesvirus 1)，属于疱疹病毒科(Herpesviridae)，ɑ疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)，马立克病毒属(Mardivirus)。鸭瘟病毒呈球形，直径为160~180 nm，主要是由核心、衣壳、皮层、囊膜四个部分组成，基因组为双股线状DNA，长约158 kb，由长独特区(UL)、短独特区(US)以及内部重复(IR)与US两侧的末端倒转重复(TR)组成。DEV主要感染鸭、鹅及其他雁形目禽类，发病迅速、传染性强、死亡率高，严重损害鸭养殖行业的经济损失。鸭群感染鸭瘟病毒主要临床症状有体温发热至43℃以上、不进食、流泪、无精打采、排白色或绿色稀软粪便、头肿大，俗称“大头瘟”。剖检结果可看到食道、直肠和泄殖腔出血、甚至形成假膜，难以剖离，肝脏有白色出血点、脾肿大等病变。疫苗接种是预防该病的重要手段，但目前实际生产中免疫的鸭瘟疫苗为传统减毒活疫苗，诱发机体产生的抗体与野毒感染无法区分，亟需一种与传统疫苗具有同等保护效果且控制生产成本的可标记疫苗，用来开展鉴别诊断，从而用于鸭瘟的防控和净化。
疱疹病毒基因组编码多种蛋白参与组成病毒的核衣壳，主要由UL18、UL19、UL26、UL26.5、UL35和UL38等基因产物组成，其中UL35基因是疱疹病毒特定长区的基因，大小为354 bp，编码VP26蛋白，VP26为最小衣壳蛋白，通过与主要衣壳蛋白VP5结合而位于六邻体上，从而修饰衣壳，主要参与病毒粒子的晚期包装。VP26对于病毒复制和组装都是非必需的，但参与核衣壳的成熟和出芽。VP26是唯一一个不需要参与HSV-1复制的衣壳蛋白。它是病毒DNA有效包装及病毒核衣壳蛋白正确定位所必需的，它能通过促进病毒衣壳蛋白UL25整合至病毒衣壳从而调控病毒核衣壳成熟。VP26蛋白与病毒神经毒力相关，VP26缺失导致细胞培养中病毒滴度降低，UL35基因缺失HSV-1在小鼠中枢神经系统中的复制受到严重影响，提示VP26可能与病毒从潜伏期到再激活的过程有关。
为了阐明鸭瘟病毒VP26的生物学功能和VP26基因缺失株的免疫保护效果，本研究在鸭瘟病毒全长感染性cDNA克隆的基础上，采用“Red E/T两步重组技术”删除UL35基因，构建了UL35基因缺失的DEV感染性克隆，并拯救获得了基因缺失重组病毒，对重组病毒rDEV-ΔVP26的细胞生物学特性进行了研究，随后在鸭体上对其安全性和免疫保护能力进行了评估。
1材料与方法
1.1质粒载体、菌株和病毒株
pEPkanS质粒由德国柏林自由大学Osterrieder N博士惠赠；E.coli DH5α、DH10B、BL21(DE3)菌株由本实验室保存。DEV疫苗株全长感染性克隆pDEV-EF1及相应病毒rDEV-EF1由本实验室构建并保存。鸭瘟病毒强毒株CHv(CVCC AV1221)购自中国兽医药品监察所。
1.2工具酶和试剂
DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Primestar DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、胶回收试剂盒购自TaKaRa(大连)公司；DMEM培养基购自吉诺生物医药技术有限公司；磷酸钙转染试剂购自Promega公司；甲基纤维素购自Sigma公司；胎牛血清购自Gibco公司；胰酶购自Difico公司。FuturePAGETM蛋白预制胶(4%~20%)购自ACE生物技术公司，ECL化学发光试剂盒购自TaKaRa(大连)公司。
1.3试验用SPF鸡胚和实验动物
9~11日龄SPF鸡胚购自宁波纯派农业科技有限公司。30日龄的DEV抗体阴性麻鸭购自杭州萧山汉朝家禽有限公司。本研究方案、程序和内容符合涉及动物实验研究的伦理要求，批准文件号为2021ZAASLA66。
1.4 DEV UL35基因缺失突变体的构建
采用“两步Red E/T重组技术”构建DEV疫苗株UL35基因缺失株。第一步Red重组以卡那霉素(Kan)抗性基因替代UL35基因序列。以引物DEV-ΔVP26-for和DEV-ΔVP26-rev扩增pEP-Kan-S质粒模板上Kan抗性基因的DNA片段，产物经胶回收后电转化至制备的pDEV-EF1/GS1783感受态细胞，振荡培养后涂布含氯霉素(CAM)和Kan的LB平板。挑取阳性克隆提取质粒，酶切和PCR筛选正确重组的克隆(pDEV-ΔVP26-Kan)进行第二次重组。第二步Red重组将pDEV-ΔVP26-Kan质粒中的Kan抗性基因删除。即接种pDEV-ΔVP26-Kan菌落于CAM抗性LB液体培养基中，待菌液出现轻微云雾状时加入等量2%L-阿拉伯糖(L-Ara)，培养1 h后转入42℃水浴摇床培养20 min，最后32℃培养1 h，将细菌悬液稀释后涂布于含1%L-Ara和CAM抗性平板进行培养，挑取菌落同时点种于CAM和Kan平板。酶切和PCR鉴定CAM阳性和Kan阴性的菌落，筛选获得阳性克隆pDEV-ΔVP26。
表1用于缺失DEV VP26(UL35)的引物
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