滇黄精水提物促进罗伊氏乳杆菌生长增殖和定植的作用机制（二）
2方法
2.1滇黄精水提物的提取制备与菌株活化
参考陈秋定[4]方法提取滇黄精水提物及L.reuteri 1.2838的活化。
2.2滇黄精水提物对L.reuteri 1.2838增殖的影响
挑取活化后的单菌落接种于MRS培养液中培养至对数生长期作为种子液。将种子液按1∶100（v/v）接种量分别接种到MRS液体培养基和含有滇黄精水提物的MRS培养基（水提物浓度为0.0126 g·mL-1）中，37℃、180 r·min-1厌氧培养。自0 h起，每隔2 h吸取培养液加入96孔板中用全波长扫描多功能酶标仪测量OD600 nm值。所有组均设置3个重复，记录数据，绘制生长曲线。
2.3滇黄精水提物对L.reuteri 1.2838群体感应信号分子AI-2生成的影响
2.3.1 L.reuteri 1.2838与滇黄精共孵育菌液的制备
向空白MRS培养液中添加滇黄精水提物至浓度为0.0126 g·mL-1，按1∶100（v/v）接种量接种2.1中活化的种子液。厌氧条件下，37℃、180 r·min-1振荡培养16 h[4]。所得菌液在4℃条件下，12000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，向所得菌体沉淀中加入磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer saline，PBS）重悬，再次以上述条件离心，弃去上清液，洗去滇黄精水提物残留。向所得菌体中加入新的MRS培养液，调整菌液OD600 nm值为0.6-0.8，按1%接种量接种于新的MRS培养液中，37℃、180 r·min-1振荡培养2 h，取培养后菌液2 mL，12000 r·min-1离心10 min取上清液用0.22μm的滤头过滤，作为群体感应信号分子AI-2的待测样品。空白对照为未添加滇黄精水提物共孵育的L.reuteri 1.2838菌液。
2.3.2自身诱导因子AI-2的检测方法
参照陈秋定[4]和Ismail[9]的方法。制备Vibrio harveyi BB170菌株种子液，以1∶5000（体积比）转接到2216E液体培养基中作为检测样品，取9 mL哈维氏菌检测液加入2.3.1所得群体感应信号分子AI-2待测样品1 mL，30℃、180 r·min-1通气培养1 h。取2216E液体培养基重复以上操作，作为阴性对照组。到达培养时间后，每管吸取200μL加入96孔平底发光板中检测，每个样本设置3个复孔，用全波长扫描多功能酶标仪检测其化学发光量，计算AI-2活性的相对光单位（Relative light unit，RLU）。
RLU=A÷B，式中，A——待测样品化学发光量的平均值；B——阴性对照化学发光量的平均值。
2.4滇黄精水提物对L.reuteri 1.2838基因转录的影响
2.4.1 RNA的提取、文库构建及测序
采用Trizol法提取L.reuteri 1.2838菌体RNA。利用超微量分光光度计对所提的RNA浓度和纯度进行检测，用Agilent 5300生物分析仪测定RNA质量。采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法建库。在Illumina NovaSeq 6000平台进行转录组测序。
2.4.2转录组分析
实验通过RSEM对基因表达水平进行分析，指标为FPKM（Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments），利用DESeq 2、Padjust等方面对基因的表达量及差异倍数进行统计分析，确定显著差异表达基因，对差异基因进行GO分析和KEGG分析，确定差异基因的功能分布与涉及通路。
2.5逆转录实时荧光定量PCR验证
为验证转录组数据的准确性，实验通过荧光定量PCR（Real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）验证差异基因的表达水平。首先将2.4中获得的RNA反转录成cDNA，再根据转录组测序分析的结果，以16S rRNA为内参基因，选择dna K、ndk、secA基因进行验证，通过Primer 5.0软件设计引物，具体序列见表1。最后计算相对表达量差异2-ΔΔCT。
表1 qRT-RCR扩增特异引物
2.6数理统计与分析
所有实验数据均进行3次重复，采用均值±标准差表示，采用GraphPad Prism 10统计软件分析数据，进行T检验分析，检验结果均取*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001作为统计学意义差异判断标准。