植物乳杆菌发酵红枣汁的理化特性演变与总酚生成动力学分析（二）
1.3.3活菌数和理化指标测定
1.3.3.1活菌数测定
采用BioSense微生物快速立体计数仪测定活菌数。具体步骤如下：准确吸取1 mL发酵红枣汁样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，选择2-3个适宜的稀释梯度。取100μL稀释液与配套的荧光染料染色液充分混合，避免光孵育15分钟。随后将混合液全部加入检测芯片的加样孔中，将芯片放入仪器进行检测。仪器自动对荧光染色的活菌进行三维立体计数，结果直接以lgCFU/mL显示。
1.3.3.2可滴定酸含量测定
参考石彬等的方法并略作修改。精确吸取5mL发酵红枣汁样品至25mL离心管中，加水稀释至刻度线后摇匀。取一定量的样液，加入酚酞指示剂5～10滴，用0.1mol/L的ΔNaOH标准溶液滴定。可滴定酸含量计算公式如下：
可滴定酸含量（%）=cXuXk
式中：c为ΔNaOH标准溶液的摩尔浓度，mol/L;k为折算系数0.090：v为消耗ΔNaOH标准溶液的体积，mL;v0为滴定用样液的体积，mL v1为试样的体积，mL；25为样品提取液的总体积，mL。
1.3.3.3总糖含量测定
参照于梅等的方法。以葡萄糖质量浓度（μg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标，得到标准曲线：y=1.5846x+0.199 8，R2=0.991 9。按照绘制标准曲线的方法测定样品在490nm处的吸光度，代入标准曲线得到发酵红枣汁的总糖含量。
1.3.3.4总黄酮含量测定
参考谭荣华等的方法并稍作修改。取发酵红枣汁样品5mL，离心（4°C，6 000r/min，10min），取上清液备用。取上清液1mL，加入30%z醇补至6mL后混合均匀，超声提取（40∘C.30min），加人5%（204号NaNO2溶液和10%Al（NO3）3溶液各1mL，然后加入10%NaOH溶液10mL，需注意每次加入试剂均需摇匀静置6min，最后加入30%乙醇至25mL，振荡摇匀静置15min在510nm处测定吸光度。以芦丁质量浓度（μg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标，得到标准曲线：y=0.0021x+0.023 4，R2=0.996 2，根据标准曲线得到总黄酮含量。
1.3.3.5总酚含量测定
参照Turkyilmaz等的方法并稍作修改。取发酵红枣汁样品5mL，离心，取1mL上清液与无水乙醇混合，超声提取（40∘C.30min），先加入去离子水5mL，再加入福林酚试剂0.5mL和15%（204号Na2CO3溶液1mL，振荡摇匀静置，避光反应35min再用去离子水定容至25mL，在760nm处测定吸光度。以没食子酸质量浓度（μg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标，得到标准曲线：y=0.042 7x+0.039 9，R2=0.994 4根据标准曲线得到总酚含量。
1.3.4动力学研究
为探究菌体生物量和总酚含量在发酵过程中的变化趋势及其相关性，以1h为间隔点，对发酵红枣汁中菌体生物量和总酚含量进行测定，建立二者的动力学模型并进行验证，以此预测菌体生长状况及总酚含量在发酵过程中的变化。
1.3.4.1菌体生物量测定
将发酵红枣汁样品按一定比例稀释，在600nm处测定菌体生物量。将测得的吸光度与稀释倍数相乘即为菌体光密度（OD值）。
1.3.4.2菌体生长动力学模型
菌体生长变化量可以采用多种模型进行描述，其中Logistic方程是典型的“S"形曲线，普遍适用于拟合各种菌体的生长过程。因此，可以用Logistic方程对红枣汁发酵过程中菌体生长趋势进行研究。
1.3.4.3总酚含量变化动力学模型
为探索红枣汁发酵过程中总酚含量的变化趋势，拟采用Logistic方程、Sgompertz方程和Boltzmann方程建立总酚含量变化的动力学模型，比较模型的相关系数R2，取R2最大的模型为总酚含量变化的动力学模型。
1.4数据处理
利用Excel2021和IBMSPSS25.0进行数据整理和分析，采用Origin2021进行绘图和动力学模型建立，每组试验重复3次。
2结果与讨论
2.1活菌数
发酵红枣汁中植物乳杆菌的活菌数变化见图1。
图1红枣汁发酵过程中活菌数变化
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05），下图同。
由图1可知，发酵0～12h时，植物乳杆菌的活菌数呈对数增长，生长繁殖速度快，活菌数迅速增加至8.66lgCFU/mL。发酵12h后，活菌数先下降，之后植物乳杆菌在发酵红枣汁中进入稳定期，这一变化趋势可能是由于发酵后期红枣汁中的氮源等营养物质被消耗殆尽，同时代谢产物不断积累，导致红枣汁的ΔpH值发生改变，使发酵环境逐渐偏离最优状态，从而抑制了植物乳杆菌的生长。
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