棘孢木霉TCS007菌株的固态发酵条件、次生代谢产物产量影响因素（三）
2结果与分析
2.1固态发酵单因素优化
2.1.1固态培养基组分对粗提发酵产物产量的影响
按培养基中大米质量为72 g情况计，发酵21 d后，碳源类别中添加1%葡萄糖组的粗提发酵产物产量最高，为1.13 g(图1A)；氮源类别中添加1%黄豆粉和1%酵母粉组的粗提发酵产物产量最高，均为1.25 g(图1B)，综合考虑成本，后续试验选择黄豆粉作为最佳氮源。与空白对照组相比，所添加的几种无机盐都不能显著提升粗提发酵产物的产量(图1C)。此外，当葡萄糖添加量为3%时，粗提发酵产物产量最高，为1.06 g(图1D)；当黄豆粉添加量为3%时，粗提发酵产物产量最高，为1.38 g(图1E)。
图1 TCS007菌株固态发酵培养基组分单因素优化试验结果
注：图中不同小写字母表示在P=0.05水平差异显著。
2.1.2发酵条件对粗提发酵产物产量的影响
按培养基中大米质量为72 g情况计，当加水量为48 mL时，TCS007菌株粗提发酵产物产量最高，为1.32 g(图2A)；当接种量为1 mL(孢子含量1×107个/mL)时，粗提发酵产物产量最高，为1.03 g(图2B)；当初始pH为5.0时，粗提发酵产物产量最高，为1.06 g(图2C)；当培养时间为28 d时，粗提发酵产物产量最高，为1.34 g(图2D)；当培养温度为28℃时，粗提发酵产物产量最高，为0.96 g(图2E)；当光照周期为12 h/12 h时，粗提发酵产物产量最高，为1.28 g(图2F)。
图2 TCS007菌株固态发酵条件单因素优化试验结果
注：图中不同小写字母表示在P=0.05水平差异显著。
2.2固态发酵响应曲面优化
2.2.1显著影响因素筛选
本研究通过Plackett-Burman法设计试验，以确定影响TCS007菌株固态发酵粗提发酵产物产量的关键因素。采用Design Expert 10进行回归分析，得到最佳拟合方程为：Y1=0.68+0.22A1‒5.83×10‒3B1‒0.03C1‒0.05D1+0.06E1‒0.06F1+0.05G1‒0.13H1。式中，Y1为TCS007菌株粗提发酵产物产量的预测值，模型的P值为0.038(P<0.05)，证明此模型的回归方程显著且具有统计学意义。试验结果的效应评价表明，培养时间、加水量和黄豆粉添加量为3个因素为关键影响因素，影响作用由大到小依次是培养时间、黄豆粉添加量和加水量。
2.2.2中心点及条件范围确定
当培养时间为32 d、黄豆粉添加量为4%、加水量为56 mL时，TCS007菌株粗提发酵产物产量最高，为1.10 g，所以选择此点作为响应面试验各因素水平的中心点。
2.2.3关键因子的最优配比
根据最陡爬坡试验结果，确定了Box-Behnken试验的3个关键因素取值范围，对TCS007菌株粗提发酵产物产量数据进行二次多项回归拟合，得到回归方程模型为：Y2=1.16‒0.21A2‒0.03B2‒0.05C2+0.05A2B2+0.03A2C2+0.02B2C2‒0.35A22‒0.07B22‒0.05C22，R2=0.9180，矫正后的R2=0.8126。对该模型进行方差分析和差异显著性检验，P值为0.0047(<0.01)，证明此模型的回归方程显著且具有统计学意义，方程失拟项为0.8291(>0.05)，表明其失拟项不显著，模型较稳定，能很好地进行预测。
由Design Expert 10软件分析得到响应曲面图(图3)，揭示了培养时间、黄豆粉添加量和加水量3个关键因素两两相互作用对TCS007菌株粗提发酵产物产量的影响。模型预测结果为：当加水量为47 mL、初始pH值为7.0、接种量1 mL、光照周期(L/D)为12 h/12 h、培养温度28℃、培养时间29 d、黄豆粉添加量为3.5%时，TCS007菌株粗提发酵产物产量达到最大值，为1.22 g。
图3棘孢木霉TCS007菌株粗提发酵产物产量关键影响因素等高线(A、C、E)和响应曲面(B、D、F)
A2：培养时间/d；B2：黄豆粉添加量/%；C2：加水量/mL。
注：粗提发酵产物产量按培养基中大米质量为72 g情况计。
2.2.4响应面最优培养条件验证
在模型预测的最优培养条件下进行了3次重复试验，TCS007菌株粗提发酵产物平均产量为1.21 g，实际值接近预测值1.22 g，表明所构建的模型能较准确地预测真实结果。在初始培养条件下，TCS007菌株的粗提发酵产物平均产量为0.90 g，采用响应曲面法进行优化后，粗提发酵产物产量提高了1.34倍，表明优化效果较好。在最优培养基及发酵条件下，利用浅盘发酵法进一步放大发酵，棘孢木霉TCS007菌株粗提发酵产物产量可达到1.45 g。
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