脂肽对蜜蜂球囊菌生长抑制作用及其孢子萌发的影响（二）
1.2.3体外抑菌试验
采用琼脂扩散法检测脂肽Surfactin、Fengycin、Iturin对蜜蜂球囊菌的抑制作用。将直径6mm的菌饼接种于固体培养基中央，用打孔器在距离中心20mm处打1个直径6mm的孔,每个平板的孔中分别加入1mg/mL的Surfactin、Fengycin和Iturin 50μL,30℃培养4d后观察蜜蜂球囊菌生长情况。
1.2.4抑菌试验
•孢子悬浮液制备:蜜蜂球囊菌产生孢子后，用接种环刮取孢子于离心管中，尽量避免刮下菌丝，加入少量PDB培养基进行研磨破壁处理，使孢子全部释放，以镜检计数方式配成10⁶CFU/mL的孢子悬浮液。
•MIC测定:在96孔板A1~H1中加入1 mg/mL的Iturin溶液200μL，其余孔每孔加入100μL生理盐水，然后从A1~H1孔中各吸取100μL加入到A2~H2孔中混匀，以此类推，直至A10~H10孔为止。取一块新的96孔板，对应Iturin溶液工作板，孔孔对应加入相应浓度Iturin溶液10μL。新板第11列(A11~H11)不加Iturin用于阳性生长对照，加入10μL生理盐水补足体积，A12~H12正常加入10μL Iturin溶液。向新板A1~H11每孔加入90μL孢子悬浮液并混匀，第12列(A12~H12)不加孢子悬浮液用于阴性空白对照，加入90μL PDB培养基补足体积。此时新板从左到右的孔中Iturin浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39和0.2μg/mL,制备55组平行以确保数据量。将新板置于30℃培养箱中培养48h后，测定D₆₀₀nm值。D₆₀₀nm值越大，Iturin抑菌效果越差;吸光度值越小，Iturin抑菌效果越好，采用累积分布法重复测定3次，计算Iturin对蜜蜂球囊菌的MIC₅₀和MIC₉₀。
•MFC测定:取6.25、12.5、25、50和100μg/mL Iturin,分别接种于事先灭菌的PDA平板上，用涂布棒均匀涂布，培养7d后观察生长情况。蜜蜂球囊菌完全不生长的培养基对应的最小浓度即为Iturin对菌蜜蜂球囊菌的MFC值，重复测定3次。
1.2.5孢子萌发和凋亡测定
取5只无菌试管，分别加入1mL 10⁶CFU/mL的孢子悬浮液，添加Iturin溶液，使Iturin最终浓度分别为0(对照)、6.25、12.5、25和50μg/mL，每个浓度制备4平行，于30℃培养箱中培养48h,BioSense微生物快速立体计数仪观察琼脂盘中孢子萌发情况,计算孢子萌发率。
孢子萌发率(%)=孢子萌发数/孢子总数×100%
上述溶液依次经甲醇和PBS清洗处理，碘化丙啶(PI)染色后，通过激光共聚焦显微镜观察并记录细胞凋亡情况。
1.2.6细胞膜麦角甾甾醇含量测定
参照张岱方法用6.25、12.5、25和50μg/mL Iturin处理菌丝，无菌水处理菌丝作为对照组，48h后收集菌丝，加入2mL乙醇，充分研磨，超声提取1h，过夜浸提，离心取上清液，上机检测，重复测定3次。高效液相色谱条件为:色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×150mm,5μm),柱温30℃,检测波长282nm,流速1mL/min,进样体积10μL,流动相为甲醇。
1.2.7细胞壁几丁质含量测定
参照朱晓兰等方法并稍加改动，将菌丝置于6.25、12.5、25和50μg/mL Iturin中处理48h,对照组用纯水进行相同处理，称取40mg处理好的菌丝，加入9mL 8 mol/L的HCl中，于110℃烘干箱中水解4h，水解结束后取出，冷却至室温，将水解液过滤至25mL容量瓶内，用少量水多次冲洗水解管，水洗液移入同一容量瓶内，用水定容至刻度，振荡混匀。
吸取上述水洗液1.0mL到离心管内，用氮吹仪氮气吹干，将0.5mL 0.2mol/L硼酸钠溶液及5mL 1.3mg/mL的FMOC-CL乙腈溶液加入干燥后的试管内，溶解残留物，振荡混合后在室温下反应2h，衍生后的溶液可直接进行色谱分析，每个样品重复测定3次。高效液相色谱条件:色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×150mm,5μm),柱温25℃,流动相为乙腈、水，流速1mL/min，紫外检测波长254nm。
1.3数据统计分析
试验数据使用GraphPad Prism 10.1.2软件Student's t检验法进行统计分析并作图，试验结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。
2结果
2.1菌株鉴定
2.1.1菌株形态学鉴定
分离菌菌丝外观呈白色绒毛状，在30℃培养箱中培养7d左右便可铺满整个平板(图1A);异性菌丝在培养过程中可产生黑色的子实体(图1B);菌丝呈现分枝状，有隔膜，能在基质上延伸生长，形成一个网状的菌丝体(图1C);孢子囊呈黑色半透明的球状，内部包含数十个孢子球，孢子囊破裂时释放出圆形的孢子球，孢子球是孢子的集合体，孢子球裂解产生大量半透明的椭圆形孢子(图1D)。
在普通光学显微镜下，用测微尺对分离菌的孢子囊、孢子球、孢子及菌丝进行测量，结果如表1所示。分离菌孢子呈椭圆形，长度为2.1~3.1μm，宽度为1.4~1.7μm,差别不大,孢子球中包含数个孢子，直径为12~16μm不等，孢子球被孢子囊包裹，孢子囊直径在66~80μm之间,在培养基中可肉眼直接观察到。菌丝直径为3~6μm。
表1分离菌菌体各部分显微测量值(μm)
2.1.2分离菌分子生物学鉴定
18S rDNA PCR扩增产物的电泳结果见图2。由图2可知，在约600bp处有明亮条带。将PCR产物测序结果在NCBI中进行BLAST序列比对，结果与蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,GenBank登录号:GQ867785.1)18S rDNA序列相似性最高，为100%，确定该菌种为蜜蜂球囊菌。
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