苯乳酸对霍氏肠杆菌生长曲线、细胞凋亡、抑制活性、DNA的影响（一）
摘要 目的：探究苯乳酸（PLA）对霍氏肠杆菌及其生物被膜中的抑制作用。方法：通过最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）、生长曲线、流式细胞术、碱性磷酸酶（AKP）活性、细胞膜完整性、DNA 含量、运动能力、生物被膜形成量的测定与激光共聚焦观察等试验，评价PLA 对霍氏肠杆菌及其生物被膜的抑制作用。结果：PLA 对霍氏肠杆菌的MIC 和MBC 分别为1.25 mg/mL 和2.5 mg/mL，在该质量浓度下可完全抑制霍氏肠杆菌生长。流式细胞仪检测结果表明：1/2 MIC 和MIC 苯乳酸不会导致细胞凋亡和坏死，而2 MIC PLA 可造成细胞死亡。28 ℃培养下霍氏肠杆菌的生长曲线虽较37 ℃培养延滞近1 h，但未影响其最大生物量，且细胞凋亡率没有显著差异。PLA 破坏了细胞结构的完整性，造成细胞内AKP 活性降低，核酸与蛋白质泄漏；2 MIC PLA 可导致菌体DNA 含量显著降低（P＜0.05）；PLA 处理可导致霍氏肠杆菌运动能力和生物被膜生成量降低。结论：PLA 对霍氏肠杆菌及其生物被膜有较强的抑制作用。
霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）是革兰氏阴性直杆菌，周生鞭毛、兼性厌氧，可以从乳制品、牛奶、水果、蔬菜、大米和婴儿奶粉等食品中分离出来。霍氏肠杆菌在特定条件下会引起动物和人感染，属于条件性致病菌。霍氏肠杆菌与阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae）同属于阴沟肠杆菌复合群，由于抗生素的过度使用和误用，因此产生较强的耐药性。
生物被膜（Biofilm，BF）是指细菌附着在有生命或无生命物体表面后被胞外大分子物质包裹的细菌群落。生物被膜具有较强的黏附性，成型后的生物被膜耐受性增强，因其具有很强的三维结构，故能构成物理屏障，限制和阻止抗菌剂或其它化学物质的穿透，导致生物被膜中的细菌难与抗菌剂接触，产生对抗菌剂的抗性。霍氏肠杆菌会在食品与医疗设备、运输管道和排水管道上形成生物被膜，且可以长时间存在，造成更多、更广泛的污染。因此，有必要发现新的、天然的霍氏肠杆菌及其生物被膜的抑制剂。
苯乳酸（Phenyllactic acid，PLA）化学名2-羟基-3-苯基丙酸，是一种天然无毒且具有广谱抑菌作用的新型生物防腐剂。有报道证实PLA 对大肠杆菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）等有较好的抑菌活性。然而，目前有关苯乳酸对霍氏肠杆菌及其生物被膜抑制作用研究较少。
本文以霍氏肠杆菌为研究对象，测定苯乳酸对其最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，通过测定生长曲线、细胞凋亡率、细胞结构完整性、对DNA 的影响、细菌运动能力、生物被膜生成量及其微观结构来分析苯乳酸对霍氏肠杆菌及其生物被膜的作用机制。
1 材料与方法
1.1 菌株与材料
霍氏肠杆菌，渤海大学食品科学与工程学院实验室-80 ℃冰箱保存；苯乳酸、二乙酸荧光素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LB 营养肉汤、LB 营养琼脂培养基：青岛高科园海博生物技术有限公司；磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）、结晶紫溶液、碘化丙啶（Propidium iodide，PI）、吖啶橙染色液（Acridine orange，AO）、戊二醛，北京索莱宝科技有限公司；抗荧光淬灭封片剂，生工生物工程（上海）股份有限公司；碱性磷酸酶（AKP）测试盒，南京建成生物工程研究所；细菌基因组DNA 提取试剂盒、GeneRed 核酸染料，天根生化科技（北京）有限公司。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2FD 型洁净工作台，苏景集团苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-50L-Ⅰ型立式高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；LRH-150 型生化培养箱，昆山一恒仪器有限公司；MS105UD型电子分析天平，瑞士梅特勒-托利仪器有限公司；THZ-D 型台式恒温振荡器，苏州培英实验室设备有限公司；Sorvall Legend Micro21R 台式微量离心机，美国Thermo Fisher 公司；全自动生长曲线分析仪，芬兰Bioscreen 公司；Victor X3 型酶标仪，美国Perkin Elmer 公司；Accuri C6 Plus 流式细胞仪，上海实维实验仪器技术有限公司；UV2550 型紫外-可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；F7000 荧光分光光度计，日本日立株式会社；GelDoc XR+全自动凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司；TCS-SP5 II 激光共聚焦显微镜，德国徕卡仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌悬液的制备 将贮藏于-80 ℃冰箱中的霍氏肠杆菌取出解冻，接种于LB 肉汤培养基中，分别在28 ℃和37 ℃，160 r/min 摇床中振荡培养12 h 后，重新接种于新鲜LB 肉汤培养基中培养至霍氏肠杆菌对数生长期，稀释至浓度为105～106 CFU/mL，备用。
1.3.2 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定 采用微量肉汤二倍稀释法测定苯乳酸对霍氏肠杆菌的MIC。使苯乳酸终质量浓度分别为10.000，5.000，2.500，1.250，0.625，0.313，0.156，0.078 mg/mL。分别在28 ℃和37 ℃培养箱内静置培养24 h，观察结果。以肉眼观察，无菌生长的最低质量浓度即为苯乳酸的MIC。将无菌生长的孔中培养液吸出100 μL 涂布于LB 营养琼脂培养基平板上，分别继续在28 ℃和37 ℃培养箱内静置培养24 h，无菌落形成的浓度即为苯乳酸的MBC。
1.3.3 霍氏肠杆菌生长曲线的测定 将苯乳酸溶液加入到霍氏肠杆菌菌悬液中，使其终质量浓度为1/2 MIC、MIC、2 MIC，以未添加苯乳酸的菌液为对照组，使用全自动生长曲线仪分别在28 ℃和37 ℃下培养24 h，每间隔1 h 测定OD600nm 值，并绘制霍氏肠杆菌生长曲线。
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