梅花鹿体细胞航天诱变、细胞样品回收培养技术、生长曲线及核型特性（二）
1.3.2具体实施方式
（1）PVDF膜软化：将PVDF膜剪成3.5 cm×3.1 cm的长方形小块后，放入洁净烧杯中进行高压灭菌。然后将PVDF膜置于10 cm培养皿中，加入适量Alpha-MEM培养液浸泡4~5 d。
（2）PVDF膜铺板：用灭菌的手术镊将软化的PVDF膜铺到6孔板中，并贴于孔底。
（3）接种细胞于PVDF膜培养：将细胞以（2~3）×10⁶的数目接种到铺有PVDF膜的6孔板中，加入含有FBS的1×液体培养基，并置于5%CO₂、37℃培养箱中培养2~3 d。
（4）“细胞-PVDF膜”导入冻存管：弃掉液体培养基，将贴附生长成纤维细胞的PVDF膜卷入2 ml细胞冻存管中，并加入2 ml尚处于液体状态下的0.5%琼脂培养基。于室温放置5 min后，液态琼脂培养基凝结为固体培养基。
（5）气相平衡处理：将冻存管盖在松弛状态下放入5%CO₂、37℃培养箱中平衡过夜，使冻存管中的气相环境与培养箱相同。
（6）封口并标记：第2天取出冻存管，盖子拧紧后，用石蜡进行密闭封口。贴上标记细胞种类等详细信息的标签并装管。
（7）送样上太空：将样品送达指定地点，并在太空中（5~40℃，距地100~300 km）飞行12 d左右。
（8）细胞样品回收：待返回舱落地后取回各细胞样品，并带回实验室进行回收处理。将每个冻存管用酒精擦拭后放入超净台，取出PVDF膜，PBS冲洗2次后，加入3 ml 0.25%胰酶消化2次，每次5 min。加入同体积的1×液体培养基终止消化。冲洗用的PBS、消化和终止的液体培养基均收集到15 ml离心管中，1 500 r/min离心5 min。
（9）细胞培养：弃上清，加入1 ml液体培养基重悬，于5%CO₂、37℃培养箱中进行培养。
（10）拍照、传代和冻存：细胞生长到80%汇合度后进行拍照，其中一部分用于传代培养，其余全部进行冷冻保存。本实验设计初衷，是要获得可以稳定遗传的航天诱导变异细胞系，这样的细胞系才能用于育种材料。
1.4对照组梅花鹿体细胞的培养方法
同样按照本实验室自主研发的新型成纤维细胞PVDF膜培养方法，即提供一种利用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜和琼脂固体培养基，把梅花鹿体细胞放入细胞冻存管，在室温（25℃）避光条件下放置12 d作为对照组。
1.5航天诱变组和对照组梅花鹿体细胞生长曲线的测定
本实验所用方法是台盼蓝染色计数法。将航天诱变组和对照组梅花鹿体细胞分别在24孔板中传代培养到6~12代时，取3孔进行生长曲线计数。具体操作是，弃去原有培养液，用DPBS冲洗细胞后，加入0.25％胰蛋白酶消化2~3 min。细胞脱壁后加入含10%FBS的α-MEM培养液终止消化，用0.4%的台盼蓝溶液（GIBCO公司）与各种细胞悬浮液以1︰9体积混合均匀，然后在倒置显微镜（Nikon TS100）下用XB-K-25血球计数板（中外合资上海求精生化试剂仪器有限公司）计数，在3 min之内记下活细胞数，并计算各样品均值。按照上述实验步骤对每个细胞样品3次重复计数，每次实验共统计8 d。根据以上生长曲线检测数据，应用Logistic生长模型进行拟合生长曲线分析。
1.6航天诱变组和对照组雌性梅花鹿体细胞的拟合生长曲线分析
采用IBM SPSS Statistics 23统计软件回归分析程序中的非线性回归分析子程序，得到相应各个参数（parameter）的估计值（estimated value）与拟合度（degree of fitting）（R²值），参数A为极限细胞生长量，即达到平台期的细胞量，B为常数尺度（constant scale），k为瞬时相对生长率（instantaneous relative growth rate），t为细胞生长时间（cell growth time），Y为细胞量（cell volume）。然后计算相关参数，包括初始细胞量、拐点细胞量（inflexion cell volume）和拐点时间（infiltration time）。根据初步模拟分析，选用Logistic数学模型拟合航天诱变组和对照组雌性梅花鹿体细胞生长过程，模型表达式为Y=A/(1+B·e⁻ᵏᵗ)。比较生长差异，即初始细胞量、拐点细胞量和拐点时间的差异。曲线拟合度指标用相关指数衡量所拟合曲线的拟合度（R²）：
R²=1−∑(Y−Ŷ)²/∑(Y−Ȳ)²，
式中，Y表示实验所得细胞量，Ŷ表示拟合曲线估计细胞量，Ȳ表示实验所得细胞量的平均值。
1.7航天诱变组和对照组梅花鹿染色体标本的制备和核型分析
参照张静南等的方法，取培养在6孔培养板中处于对数期生长的航天诱变组和对照组雌性梅花鹿体细胞，在培养液中加入新鲜配制的20 g/L的秋水仙素（Sigma），即在6孔培养板每孔2 ml的培养液中加入0.02 ml的秋水仙素。之后把细胞样品再放入培养箱中继续培养2.5~3.0 h，取出培养板用0.25%胰酶消化3 min，加入含10%FBS的MEM-Apha培养液终止消化。1 500 r/min离心5 min，弃上清液，在离心管中收集细胞，用注射器在细胞沉淀中缓慢滴加37℃预热好的0.075 mol/L KCl（Amresco）低渗液8 ml，用吸管吹打均匀。把细胞置于37℃恒温水浴中低渗处理40 min。在低渗结束前1 min加入1 ml新鲜配制的固定液，即3︰1体积比的甲醇（西陇化工股份有限公司）与冰醋酸（天津化学试剂有限公司）混合液，对检测细胞进行预固定，用吸管轻轻吹打均匀，1 000 r/min离心10 min，然后弃去上清液。用注射器在预固定的细胞沉淀中再次缓慢滴入8 ml固定液，混匀后置37℃恒温水浴固定处理30 min，之后1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，再次重复上述的固定程序2次。最后在细胞沉淀物中加入固定液0.5 ml，用吸管轻轻吹打均匀，制成细胞悬液。将细胞悬液从1 m高处滴在冰水浸泡过的洁净玻片上，自然晾干，即为常规染色体（chromosomes）标本。染色体标本用Giemsa液染色10~15 min，Giemsa液为Giemsa原液（Sigma）与纯水按1︰9的比例稀释，之后，自来水轻轻正反面冲洗后自然晾干、镜检。航天诱变组和对照组梅花鹿体细胞染色体标本经Giemsa染液染色完成后，运用细胞遗传工作站（applied imaging，AI）软件分析结果。
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