小龙虾贮藏过程中优势腐败菌筛选、及微生物菌群结构分析（三）
2.4 4℃贮藏小龙虾高通量测序结果分析
2.4.1小龙虾4℃贮藏期间微生物群落的α-多样性
α-多样性分析可以反映小龙虾样品中微生物的多样性（丰富度及均匀度），由多种指数进行评价，主要包括反映微生物群落丰富度的Ace指数、Chao 1指数和Richness指数，可以体现微生物群落多样性的Shannon指数和Simpson指数，以及覆盖率。
表3不同贮藏时期小龙虾微生物群落的α-多样性
由表3可知，Ace指数、Chao 1指数及Richness指数随着贮藏时间的延长逐渐减小，这说明小龙虾样品在贮藏过程中微生物群落丰富度不断降低，微生物群落中物种种类逐渐减少，出现了优势菌属。而代表样品中微生物群落多样性的Shannon指数和Simpson指数也均降低，表示贮藏过程中小龙虾样品的微生物多样性也在逐步降低，物种均匀度下降。说明在小龙虾贮藏后期，出现了在数量上占绝对优势的细菌，并且这些细菌可能抑制了其他种类细菌的生长，从而降低了微生物群落的多样性。
图4不同贮藏时间小龙虾稀释曲线（A）和Shannon曲线（B）
稀释曲线体现对小龙虾样本的取样深度，可以用来评估测序量的合理性。由图4A可知，随着测序深度的增加，小龙虾稀释曲线逐渐平缓，说明测序量足够且充分，测序样本能够合理反映样品中物种信息。由图4B可知，Shannon指数曲线也逐渐趋向平缓，代表微生物多样性不会再增加。同时表3中覆盖率均大于99%，因此，上述数据可以证明小龙虾样本的高通量测序数量合理，且能够正确反映出小龙虾样品中微生物的多样性及丰富度。
2.4.2小龙虾4℃贮藏期间细菌群落的β-多样性
图5小龙虾细菌菌群的主成分分析
对4℃贮藏小龙虾细菌群落进行基于操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）的主成分分析（principal component analysis，PCA），PCA是通过降维处理展现样本特定距离的分布方法，PCA图中不同样品间距离的远近可以反映不同样本相似性的大小。由图5可知，PC1、PC2的解释度分别为68.08%和20.03%。从样品分布可以看出，贮藏0 d样本与贮藏16 d的样本距离最远，说明其菌群组成差异最大。相对而言，贮藏8、12、16 d的样本则较为聚集，表示虽然这些样本之间存在一定的差异，但其菌群结构还是具有较高的相似度，而贮藏12 d与16 d样本距离最小，说明二者菌群结构相似度最高。小龙虾细菌菌群β-多样性的分析结果显示，小龙虾中微生物结构在贮藏过程中不断发生变化，最终造成鲜样期小龙虾与腐败末期小龙虾微生物结构之间产生较大的差异。
2.5小龙虾贮藏期间微生物物种组成及聚类分析
图6不同贮藏时期小龙虾OTU韦恩图
对测序得到的序列进行聚类分析，以98%以上的序列聚类成OTU，并根据不同贮藏时间小龙虾样本所对应的OTU绘制维恩图。由图6可知，贮藏0、8、12、16 d样品含有的OTU数分别为2 830、1 379、1 121和977。贮藏12 d（腐败中期）与16 d（腐败末期）样品中相同的OTU数为674，高出贮藏0 d（鲜样期）与16 d（腐败末期）样品约500，因此可以说明腐败中期与腐败末期的小龙虾样品微生物物种相似度更高。
图7不同贮藏时间小龙虾中微生物的属水平物种组成
由图7可知，从整体上看，小龙虾样品中物种组成差异较大。总共涉及到17个菌属，包括气单胞菌属（Aeromonas sp.）、希瓦氏菌属（Shewanella sp.）、黄杆菌属（Flavobacterium sp.）、变形杆菌属（Proteus sp.）、不动杆菌属（Acinetobactor sp.）、丛毛单胞菌属（Comamonas sp.）、漫游球菌属（Vagococcus sp.）等，高通量测序法除传统培养法筛选到的10株细菌外还鉴定出黄杆菌属、丛毛单胞菌属和漫游球菌属等7个菌属，体现了高通量测序法的准确性及全面性。随着贮藏时间的延长，小龙虾鲜样期相对丰度较大的细菌，如丛毛单胞菌属、漫游球菌属逐渐减少，而气单胞菌属、希瓦氏菌属相对丰度则逐渐增加并成为优势菌群。在鲜样期（0 d），气单胞菌属、希瓦氏菌属相对丰度分别为1.40%、0.82%。而随着贮藏时间的延长，其相对丰度迅速增大，在贮藏末期（16 d），2种细菌的相对丰度分别达到38.7%、18.9%。结合传统培养法在小龙虾中筛菌结果可知，本实验中小龙虾样品的优势腐败菌为气单胞菌及希瓦氏菌。冷藏小黄鱼的优势腐败菌为变形杆菌及希瓦氏菌，而朱素芹等在凡纳滨对虾中筛选得到的优势腐败菌则为希瓦氏菌及不动杆菌，与本研究中产自武汉孝感的4℃贮藏小龙虾中筛选分离得到的优势腐败菌为希瓦氏菌及气单胞菌有所差异，可能是由于不同品种的水产品优势腐败菌有所差异。而本研究优势腐败菌种类与先前研究得出的小龙虾中优势腐败菌为希瓦氏菌、肉食杆菌、阴沟肠杆菌的结论也稍有不同，这说明即使是同一种水产品，其优势腐败菌也会因产地和贮藏温度的影响而发生变化。
3结论
本研究对产地为武汉孝感的冷藏小龙虾中优势腐败菌进行筛选鉴定，并对小龙虾贮藏过程中微生物结构变化及多样性进行分析。传统培养法从冷藏小龙虾中共筛选出维氏气单胞菌、波罗的海希瓦氏菌、普通变形杆菌等10株细菌，结合高通量测序结果，最终确定小龙虾中主要优势腐败菌为气单胞菌属和希瓦氏菌属。同时，高通量测序结果表明，小龙虾在贮藏过程中微生物结构一直在变化。某些细菌数量逐渐减少，如在鲜样期（0 d）小龙虾中相对丰度较大的细菌丛毛单胞菌属在腐败末期小龙虾中相对丰度小于1%。而气单胞菌属、希瓦氏菌属相对丰度在贮藏过程中一直增大，并最终占据腐败小龙虾中微生物的主导地位。在腐败末期，气单胞菌属、希瓦氏菌属、变形杆菌属、不动杆菌属、柠檬酸杆菌属、巨球菌属6种菌属的总相对含量为85%以上。α-多样性分析表明，小龙虾鲜样期OTU数量最多，菌群群落结构丰富度、多样性及均匀度最高。而随着贮藏时间的增长，多样性、丰富度及均匀度都在下降，尤其是在腐败末期到达最低，这可能与优势腐败菌的大量繁殖及繁殖过程中对其他细菌生长的抑制有关。β-多样性分析则表明，鲜样期与腐败末期菌群结构差异较大，而腐败中期与腐败末期差异较小，这与α-多样性分析结果相一致。对冷藏小龙虾优势腐败菌的筛选鉴定、细菌群落结构和多样性分析，为今后利用保鲜技术靶向杀灭腐败菌、延长货架期、降低经济损失提供了一定的理论参考，同时也为今后开发新的小龙虾品质安全检测及保鲜杀菌技术提供了思路。
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