1.3方法

1.3.1荧光法快速药敏质控菌验证

分别挑取37℃生长18~20 h的金黄色葡萄球菌ATCC29213、粪肠球菌ATCC29212、大肠埃希菌ATCC29292、铜绿假单胞菌ATCC27853，使用无菌0.85%生理盐水制成1.5×10^8 CFU/mL菌悬液，并按比例配制100μL反应体系(包含1×10^4 CFU菌悬液35μL、反应液25μL、Mueller-Hinton肉汤94μL)，每间隔1 h使用化学发光免疫分析仪LUMO进行RLU测定并绘制荧光曲线。其中反应液为自配荧光素酶催化混合液，具体配方为使用缓冲液(HEPES 47.6 mg/mL、EDTA 8.5 mg/mL、MgCl₂·6H₂O 4.0 mg/mL，调整pH至7.5)配制D-荧光素钠盐溶液(1.5 mg/mL)，测试前添加3 mg/mL荧光素酶冻干粉，充分溶解后即为反应液。

1.3.2临床菌株荧光法快速药敏测试

使用0.85%生理盐水配制0.5 McF浊度的质控菌和临床分离的184株革兰阳性、阴性菌株菌悬液，Mueller-Hinton肉汤及包含2倍稀释梯度的药物浓度：包括头孢西丁(16~0.5)μg/mL，万古霉素(32~0.12)μg/mL，头孢噻肟(28~4)μg/mL，利奈唑胺(8~0.25)μg/mL，美罗培南(16~0.03)μg/mL，环丙沙星(4~0.03)μg/mL，妥布霉素(16~0.12)μg/mL，阿米卡星(64~0.25)μg/mL，庆大霉素(16~0.12)μg/mL，红霉素(8~0.03)μg/mL，头孢噻肟(64~0.5)μg/mL，头孢他啶(32~0.06)μg/mL，配制反应体系后放于(35±2)℃温箱进行孵育培养，每间隔1 h进行RLU测定，绘制不同时间荧光变化曲线；同时参照CLSI M100文件进行微量肉汤对比测试确定各抗菌药物MIC。

2结果

2.1荧光法快速药敏质控菌验证

将4株革兰阴性、革兰阳性药敏质控菌与荧光素酶催化混合液共同孵育后，获得RLU值变化曲线(图1)。由图知孵育前1 h内，由于金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠埃希菌ATCC29292和铜绿假单胞菌ATCC27853延迟延长期的影响，导致RLU出现自然衰减，至延长延迟延长期后出现连续上升。其中铜绿假单胞菌ATCC27853为专性需氧菌，生长缓慢延迟期较长，培养至5 h后RLU值出现升高，细菌开始增殖，代谢活性增强。粪肠球菌ATCC29212生长延迟期较短，代谢旺盛，未发现RLU值明显衰减。

图1孵育过程中质控菌荧光曲线

2.2质控菌荧光法药敏结果

荧光素酶生物发光法快速检测质控菌-抗生素作用荧光曲线共发现2种类型：①生长依赖型(图2)，即抗生素抑制细菌生长过程中，荧光素酶催化底物ATP来源于细菌生长且不被破坏中释放，产生发光，计算发光率[发光率=(不加抗生素后RLU值-加抗生素后RLU值)/不加抗生素后RLU值×100%]，当发光率≤90%时为耐药，≥90%时为敏感；②死亡依赖型(图3)，即抗生素抑制细胞壁的合成而导致细菌细胞膨胀破裂死亡释放ATP，并产生发光，计算发光[发光率=(加抗生素RLU值-不加抗生素RLU值)/不加抗生素后RLU值×100%]，当发光率≤100%时为耐药，当100%为敏感。在对质控菌进行荧光法微量肉汤和微量肉汤稀释法对比检测MIC实验结果中，根据荧光曲线特征定义MIC值，结果发现2种方法检测的革兰阳性菌和革

图2金黄色葡萄球菌-利奈唑胺作用荧光曲线

图3铜绿假单胞菌-头孢他啶作用荧光曲线

兰阴性菌MIC的EA与CA均为100%(表1-2)，且均在质控范围内。另外，常规微量肉汤稀释法的检测周期为16~24 h，荧光微量肉汤法药敏实验对4株质控菌的检测周期为5~6 h，检测周期大幅，缩短结果读出更加直观简便。

表1 革兰阴性质控菌药敏检测结果(μg/mL)

抗菌药物	大肠埃希菌ATCC29292		质控范围	铜绿假单胞菌ATCC27853		质控范围
	荧光法	微量肉汤		荧光法	微量肉汤
头孢他啶	0.25	0.25	0.06-0.5	2	2	1-4
环丙沙星	0.008	0.008	0.004-0.016	0.5	0.5	0.12-1
美罗培南	0.05	0.05	0.008-0.06	0.5	0.5	0.25-1
妥布霉素	0.15	1	0.03-0.12	8	16	8-32
头孢噻肟	0.06	0.125	0.05-4	1	2	1-4
阿米卡星	1	1

表2 革兰阳性质控菌药敏检测结果(μg/mL)

抗菌药物	金黄色葡萄球菌ATCC29213		质控范围	粪肠球菌ATCC29212		质控范围
	荧光法	微量肉汤		荧光法	微量肉汤
头孢西丁	2	4	1-4	7	7	7
庆大霉素	0.25	0.5	0.12-1	8	16	4-16
万古霉素	1	1	0.5-2	1	2	1-4
红霉素	0.25	0.5	0.25-1	16	16	1-4
利奈唑胺	16	16	8-32	2	2	1-4
注：“7”代表该质控菌无法抵抗该抗生素。

2.3临床菌荧光法药敏结果

临床样本分离得到的93株革兰阳性菌和91株革兰阴性菌分别应用荧光素酶生物发光法和微量肉汤法进行药物敏感性测定。根据对应的荧光曲线拐点特征定义MIC值并统计EA和CA值(EA：基本一致性，被测系统MIC值与参考方法或对比方法MIC值相差不超过1个对稀释梯度的一致性；CA：分类一致性，被评估的药敏方法与参考方法或对比方法相比，判断结果为敏感、中介、耐药依赖敏感和耐药的一致性，可接受标准：EA≥90%，CA≥90%)。结果表明金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌等革兰阳性菌，共558个药敏对比实验，其中头孢西丁、庆大霉素、红霉素、万古霉素和利奈唑胺共5种抗生素的EA和CA值均大于90%，但呋喃妥因表现出较低的分类一致性(84.81%)。此外，粪肠球菌对利奈唑胺EA值较低，仅为66.67%(表3)；大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌等革兰阴性菌，共546个药敏对比实验，测试6种抗生素的EA和CA值对均均大于90%，但大肠埃希菌、铜绿假单胞菌整体体内MIC值较低，可分别为85.70%和81.25%(表4)，且每组测试均在6h内绘制荧光曲线，较常规药敏实验大幅缩短了检测周期。

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