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适用于贵州贞丰地区的发酵床微生物菌剂生长曲线

发酵床技术从2004年从日本引进到国内,从原先单一菌剂发酵床到复合菌剂发酵床的开发应用,使得发酵床技术逐步稳定成熟。发酵床菌剂应用广泛,在用于制作发酵床方面,可以达到分解动物粪便的目的,从而增加效益、减少污染等。


贵州地处喀斯特地貌,多气候的特殊环境,微生物菌剂在贵州产酶、产孢等能力减弱。此外,贵州不同地区环境气候等差异较大,同一株微生物在不同地区的繁殖代谢能力也不一样。


目前,现有的发酵床菌种在贵州地区的应用存在以下缺陷:


1.现有发酵床菌种复合配方同质化严重,并且在贵州的实际表现能力较差,死床率高等。


2.现有发酵床菌种成本高,效果不佳,应用时间短。


为此,下面一种适用于贵州贞丰地区的发酵床菌剂及制备方法,以解决上述问题。


在贞丰地区采集土著微生物,并在实验室分离培养发酵床核心菌群,对核心菌群的生长曲线,代谢酶浓度测定评估,组合形成适用于贵州贞丰地区的发酵床菌剂配方。涉及的菌种及配方能较高适宜贞丰地区发酵床应用及持续稳定运营。


菌种保藏


芽孢杆菌:拉丁学名为Bac i l l us sp.,保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC NO:63150。


乳球菌:拉丁学名为:Lactococcus sp.,保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC NO:63149。


植物乳杆菌:拉丁学名为:Lact i p l ant i bac i l l us p l antarum,保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC NO:63152。


酵母菌:拉丁学名为Saccharomyces sp.,保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC NO:63151。


屎肠球菌,拉丁学名为Enterococcus faec i um,保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC NO:63145。

乳球菌的生长曲线图;

芽孢杆菌的生长曲线图;

酵母菌的生长曲线图;


屎肠球菌的生长曲线图;


适用于贵州贞丰地区的发酵床菌剂及制备步骤:


1)、采样:将7分熟的米饭装入采样木盒中,滴上6-7mL营养液,放入贞丰长田镇甘田村深山内,挖坑将培养盒放入,用腐殖土和白色菌丝体土壤覆盖,并在四周挖排水沟,防止水直接进入培养土坑中,7日后返回收集样本。


2)、样品前处理:用1:1甘油保存液将部分样本进行保种;取1mL液体,用9mL生理盐水稀释,记住10-1浓度,以此方法逐级稀释至10-5、10-6浓度,选用肉汤培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行初筛,将10-5、10-6浓度的稀释液各取1mL涂布于肉汤培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基中,36℃培养72h。


3)、培养基配制:肉汤琼脂培养基(牛肉粉5g、蛋白胨20g、氯化钠5g、琼脂15g、水1000mL、pH7.0~7.2),马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g、琼脂15g、水1000mL),屎肠球菌选择性培养基(月示胨10g,麦芽糖10g,酵母粉10g,甘油磷酸钠10g,氯化钠5g,乳糖1g,溴甲酚紫0.015g,叠氮钠0.4g,TCC 0.1g,琼脂13g),LB琼脂胨培养基(胰蛋白胨10g,酵母浸粉5g、氯化钠10g、琼脂15g、水1000mL、pH6.9~7.1)、MRS琼脂培养基(胰酪胨10g、牛肉膏粉5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、吐温80 1g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂15g、水1000mL、pH6.0~6.4),酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD琼脂培养基:蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母浸粉10g、琼脂15g、水1000mL、pH6.3~6.7),LB液体胨培养基(胰蛋白胨10g,酵母浸粉5g、氯化钠10g、水1000mL、pH6.9~7.1)、MRS液体培养基(胰酪胨10g、牛肉膏粉5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、吐温80 1g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、水1000mL、pH6.2~6.4),酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基(YPD液体培养基:蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母浸粉10g、水1000mL、pH6.3~6.7)。


4)、菌种复筛:初筛菌种培养结束后,从肉汤培养基上选取1-2株菌落分别在MRS琼脂、LB琼脂、屎肠球菌选择性培养基上进行涂布,38℃培养72h;从PDA琼脂培养基上选取形态结构较大菌落在YPD琼脂培养基涂布,30℃培养7d。


5)、菌种鉴定检测:从4组培养基中分离出的菌种通过析泽生物Z200菌落计数器进行菌落形态分析,结合菌种生长形态结构初判菌种种类;其次将菌泥使用革兰氏染液染色后进行镜检;无法判断的菌种再培养后送往苏州帕米诺克生物公司测序鉴定。


6)、菌种生长曲线检测:将分离纯化的菌种按照5%的菌液接种量接种到对应液体培养基中,每隔1h取样5mL,利用普析T6紫外分光光度计在620nm测定菌种OD值。


7)、产品对照实验:采购某品牌发酵床菌剂10kg,取1g菌粉置于肉汤培养基中进行培养,38℃培养72h;分离纯化贵州地区菌种主要为芽孢杆菌、乳球菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、酵母菌等,将分离纯化菌种在对应培养基中进行扩繁培养,培养结束后使用卢湘仪18M离心机离心,将离心菌泥与保护剂1:1混合后使用四环福瑞0.05平方实验室小型冻干机冻干32h,冻干后的单菌粉其复合比例为4:1:1:2:2,将复合后的复合菌粉1g也置于肉汤培养基中38℃培养72h。将培养好的菌液测定其活菌数、pH、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶。


8)、贞丰地区验证实验:将市场产品和复合好的贞丰地区菌种产品都按1:5与玉米面混合撒匀在甘田村发酵床上进行产品临床实验,每月进行1次采样,采样后测定活菌数、pH、酶活等。


结果表明:乳球菌在48h时达到最大峰值,芽孢杆菌和酵母菌在20-30h之间达到峰值,生产繁殖情况较市场购买菌种优异。


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