孢汉逊酵母、美极梅奇酵母等菌株生长曲线测定及酿酒因子耐受性分析（一）
现代葡萄酒生产企业为了实现酿造过程的良好管理并提高发酵效率，大多采用单一商业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行酒精发酵，导致葡萄酒的风格同质化严重，缺乏产区风土特色。然而，事实上葡萄酒发酵是由多种属微生物等共同完成的复杂生物学过程。源自葡萄果皮的非酿酒酵母（non-Saccharomyces yeast，NS）菌株在酒精发酵前期占主导地位，至中、后期才由于酒精耐受性较差以及与酿酒酵母的相互作用，逐渐被S.cerevisiae取代。越来越多的研究表明，适应了产区风土的NS菌株具有独特的酿造学特性，在酒精发酵过程中会改变葡萄酒中可滴定酸和乙醇含量、增加甘油含量、释放甘露糖蛋白、修饰花色苷、提高挥发性香气化合物种类及含量，对葡萄酒的风味品质和感官特征多元化具有积极贡献。此外，部分NS菌株还可以分泌与葡萄酒香气转化释放相关的风味酶，促进萜烯类、酯类和醇类物质的释放或合成，对改善酒体的香气风格和典型性具有重要意义。
葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）和戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）是目前研究和应用最多的葡萄酒相关NS菌种。MUÑOZ-REDONDO等发现，T.delbrueckii与酿酒酵母混菌发酵，降低了葡萄酒中乙醇及部分中链脂肪酸乙酯的含量，但能增加部分重要酯类化合物含量，对提高桃红葡萄酒香气复杂性具有重要贡献；接种M.pulcherrima进行发酵的葡萄酒中酯类物质、花青素和单宁含量增加，乙醛含量降低。ZHANG等的研究中发现本土H.uvarum参与发酵可使‘赤霞珠’葡萄酒的乙酯含量增加48.54%～59.55%、而‘霞多丽’葡萄酒中的乙酯含量提高了96.94%～110.92%。整体而言，现阶段有关NS菌株的研究主要集中于其和S.cerevisiae的随机组合发酵对葡萄酒化学组分的影响，但对不同种属本土NS菌株在纯种发酵条件下的酿造学差异分析还十分欠缺，致使酿酒师无法按照葡萄浆果状态和酿造意愿充分呈现NS对葡萄酒应有的特定贡献。因此，急需深入明晰特定NS菌株的独有酿造学特性，为靶向设计S.cerevisiae与NS的混菌发酵策略奠定基础。
本试验以筛选自中国河西走廊葡萄产区的葡萄汁有孢汉逊酵母（H.uvarum）HX-1、HX-3，美极梅奇酵母（M.pulcherrima）HX-2、HX-4和戴尔有孢圆酵母（T.delbrueckii）HX-6、HX-7为供试菌株，以菌株的生长曲线和酿酒因子耐受性分析为基础，进行‘美乐’葡萄汁纯种发酵试验；系统分析其发酵特点和产香性能，揭示本土NS菌株的酿造学特性差异，以期为科学选择混菌发酵剂组合和接种策略、定向改善葡萄酒感官风格提供有益借鉴和参考。
1.材料与方法
1.1试验材料
6株NS菌株均筛选自河西走廊葡萄酒产区自然发酵葡萄酒样。通过26S rDNA D1/D2鉴定，确定菌株HX-1、HX-3为H.uvarum，HX-2、HX-4为M.pulcherrima，HX-6、HX-7为T.delbrueckii，具有良好的葡萄酒/果酒酿造应用潜力。−80℃甘油管保存藏于甘肃农业大学食品科学与工程学院葡萄酒微生物实验室。
YPD液体培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L，121℃高压（103.4 kPa）灭菌20 min。
WL培养基：购自北京奥博星生物技术有限责任公司。称样80.25 g，加入1 000 mL蒸馏水。115℃高压（70 kPa）灭菌20 min。
‘美乐’葡萄：2023年9月采自甘肃莫高葡萄酒厂种植基地，还原糖含量229.63 g/L、可滴定酸（以酒石酸计）含量5.65 g/L、pH值为3.61。
1.2菌株活化
保藏在甘油管中的各非酿酒酵母分别在YPD液体培养基中28℃活化培养48 h，随后将菌液稀释涂布于WL固体培养基再次28℃培养48 h。挑取单菌落接种于YPD液体培养基中28℃进行扩培增殖，生物量达到106 cfu/mL时，备用接种。
1.3生长特性测定
1.3.1非酿酒酵母生长曲线
采用YPD培养基能够保证酵母生长的稳定性和一致性，真实反映供试菌株的生长状况。将各供试菌株以1×106 cfu/mL接种于YPD液体培养基，28℃恒温培养。每隔4 h测定菌悬液在600 nm波长下的OD值。各试验组均设置3个生物学重复，取平均值绘制生长曲线。
1.3.2酿造因子耐受性分析
将生长至对数生长后期的供试菌株，以1×106 cfu/mL依次分别接种于pH值为2.0、2.5、3.0、3.5和4.0，乙醇体积分数为3%、6%、9%、12%和15%，SO2质量浓度为50、100、150、200和300 mg/L，葡萄糖质量浓度为100、150、200、250和300 g/L的YPD液体培养基中，28℃培养至稳定期后，采用分光光度法测定OD600值。此外，将供试菌株以1×106 cfu/mL接种于YPD液体培养基，分别置于10、15、20、28和35℃条件下培养至稳定期后测定OD600值，分析不同温度对菌株生长的影响。各处理组均包括3个生物学重复，下同。
1.3.3絮凝试验
供试菌株在YPD培养基中25℃培养48 h后，6 000×g离心8 min，除去上清液。将酵母细胞用含5 mmol/L EDTA和50 mmol/L柠檬酸钠的缓冲液（pH值为3）洗涤2次并置于缓冲液中，细胞浓度控制在5×107 cfu/mL。取5 mL悬浮液中加入20 mmol/L CaCl2，25℃下50 r/min振荡试管5 min以诱导絮凝。取200μL上清液加入1 mL 250 mmol/L的EDTA，每30 s测量吸光度OD600，持续10 min。以未添加CaCl2的酵母细胞悬浮液作为对照。
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