人类微生物组遗传与地理信息和物种水平传播能力相关性研究（二）
种内遗传距离与宿主的地理距离相关
我们评估了来自24829名个体的32152份肠道宏基因组样本。这些样本主要为欧洲样本（65%），主要归因于荷兰裔个体数据集的贡献（占总数的35%），其中15.8%来自北美，14.3%来自亚洲，3.83%来自非洲，0.5%来自大洋洲和南美洲（图1A；表S1.1）。我们使用StrainPhlAn 4，对1660个物种水平基因组箱（SGBs，以下用作与“物种”同义的操作定义）进行了系统发育重建，这些物种有足够样本且覆盖度充足（STAR方法；图1B；表S1.3）。
图2 | 系统发育树的地理分层
（A-D）基于地理多样性和样本量选择的代表性SGB系统发育树，标注了样本采集的大陆信息。为便于可视化，由于荷兰样本对应的分支数量过多，已从系统发育树中排除。
（E）地理遗传效应与物种传播能力估计值呈负相关，表明更易在人群间传播的微生物更不容易出现基于地理的遗传分层。仅显示具有显著地理关联的SGB，文中提及的物种以红色高亮。线性平滑曲线显示x轴与y轴特征之间的拟合关系，灰色阴影代表拟合线的95%置信区间。
接下来，我们鉴定出了比其他类群表现出更强地理效应的特定分类群。基于排序的富集分析（STAR方法）显示，与其他科相比，毛螺菌科的SGB总体表现出更高的地理效应（集合富集分析[SEA]，标准化富集分数[NES] = 1.44，p = 3.56×10-5，FDR = 0.01）（图2A；表S3.2）。这一富集现象在毛螺菌科所属的目——梭菌目中也显著（NES = 1.33，p = 1.8×10-4，FDR = 0.037）。有趣的是，梭菌目属于芽孢杆菌门Bacillota（原厚壁菌门Firmicutes），而此前研究发现该门是与人类种群共多样化表现最显著的门类。因此，我们确实发现证据支持人类肠道微生物群的种内遗传变异与地理变异相关，微生物系统发育与地理因素之间的最强关联可能存在于被认为与人类共享最强进化史的进化枝中。
地理分层与微生物水平传播速率相关
随后，我们探究了具有地理关联的SGB是否共享特定特征，如传播能力（指示微生物在宿主间的传播）、平均基因组大小、代谢能力、表型特征（使用Traitar从每个SGB的核心基因预测）以及在不同生态位中的存在情况。我们鉴定出11种与地理分层相关的微生物表型（图2B；表S3.3），并发现3种与生态位存在的正相关，包括非西方化微生物组、古代粪便样本和非人灵长类（FDR < 0.05）（表S3.4）。
我们假设，水平传播能力强的进化枝更不易受地理分层影响，因为它们更可能跨越地理屏障并在人群中扩散，从而使系统发育与地理因素脱钩。为验证这一假设，我们计算了583个SGB在同一国家不同研究个体中的菌株共享事件。SGB传播速率（相同菌株的样本间比较总数/样本间总比较数）范围为0%~8.2%，中位数为2.3%。正如预期，传播能力更高的SGB地理效应更小（rPearson = -0.21，p = 3×10-7），即使仅考虑与地理显著相关的456个SGB，这一趋势依然存在（rPearson = -0.20，p = 8.85×10-6）（图2E）。
系统发育与人类表型的关联
接下来，我们着手检验宿主表型特征是否与SGB种内遗传变异相关。针对583个SGB系统发育树与256种表型的每一种组合，我们使用anpan R软件包拟合了系统发育广义线性混合模型。该模型通过评估包含与不包含系统发育信息的模型预测性能差异来判断关联性，差异以广义预期对数预测密度差值（elpd_diff）量化（STAR 方法）。我们首先进行了仅包含年龄和大陆作为协变量的初步分析。随后，针对识别出的关联，我们构建了大陆分层模型（即每个大陆单独建模），同时考虑不同国家的地理效应。
分析揭示了六大洲共484项全球性关联，涉及54种不同表型与272个独特SGB之间的389项独立关联，其中80项关联在多个大陆中重复出现（表S4.1）。为确保物种的潜在群体分层不会混淆结果，我们将每个物种的关联数量与其在前文分析中的地理分层系数相关联，结果显示支持性关联数量与地理效应无显著关联（线性模型，效应值 = 0.46，p = 0.23），排除了强地理混杂因素的影响。
总体而言，272项独立物种-表型关联（跨大陆重复出现的关联仅计数一次）包括人体测量指标（253项年龄、12项 BMI、6项性别、1项腰臀比）；疾病（13项炎症性肠病、9项精神分裂症、7项黑色素瘤、23项涉及14种其他疾病的关联）；生活方式与暴露组（8项二氧化氮、7项城市化程度、5项当前吸烟、5项其他表型）；生化指标（4项胆红素、3项高密度脂蛋白[HDL]、3项胰岛素、9项其他表型）；药物与补充剂摄入（3项质子泵抑制剂[PPIs]、2项马拉嗪、2项维生素B12、5项其他表型）；其他未分类表型（6 项）（图S3A）。各队列的可用表型列于表S1.2。
关联数量与每个大陆纳入的样本量呈正相关（Spearman相关系数rho = 0.81，p = 0.04）（图S3C和S3D），相同样本量的地理区域中，SGB-表型关联的比例相似（图S3D）。因此，大多数关联在欧洲样本中检测到（n=335），其次是亚洲（n=95）、非洲（n=48）、北美（n=8）、南美（n=1）和大洋洲（n=1）样本（图S3B）。随后对欧洲样本中少数物种-年龄关联的下采样分析显示，关联分类群的elpd_diff分数与样本量呈线性相关（非关联分类群中无此趋势）。这表明识别表型-物种关联需要相当大的统计效力，解释了各大陆间关联数量的差异（图S3C）。
尽管各大陆间SGB-表型关联的数量存在差异，但80项此类关联在大陆间可重复，即使不一定由相同进化枝驱动（图S3B）。大多数重复出现在亚洲和欧洲研究之间（47项年龄关联和2项炎症性肠病关联），其次是欧洲和非洲（37项年龄关联），最后是欧洲和北美（6项年龄、1项BMI和1项黑色素瘤关联）。若干关联在两个以上大陆中重复出现，包括在非洲、亚洲和欧洲均观察到的10项年龄关联；在北美、亚洲和欧洲均观察到的1项年龄关联；以及在北美、非洲、亚洲和欧洲均重复的2项年龄关联（涉及产气柯林斯菌和普拉梭菌）（表S4.1）。因此，我们观察到亚种遗传结构与宿主相关状况和表型之间存在广泛关联的证据，这些关联跨越大陆，可作为后续实验的假设基础。
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