草鱼性腺细胞系生长曲线测定及对鲤春病毒血症病毒敏感性研究（二）
1.2.2 GCO细胞周期分析
对第345代GCO细胞系进行细胞周期研究。将细胞转至6孔板后，约35 h后细胞处于指数生长期，形成70%-80%的汇合层。用胰蛋白酶消化法收集细胞，做成单细胞悬液，室温下1000 r/min离心5 min，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，1000 r/min离心5 min，收集沉淀。先用20-50μl/ml的杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS)将细胞沉淀充分打散成单个细胞，用4℃预冷的70%冰乙醇1 ml重悬，4℃过夜。采用流式细胞仪(Cytomics FC 500 Beckman Coulter)进行细胞周期检测。
1.2.3 GCO细胞核型分析
采用Ye等(2006)的方法制备第345代GCO细胞染色体，进行核型分析。待细胞贴壁稳定生长36 h后，在培养基中加入0.8μg/ml秋水仙素，孵育4 h。吸去培养基，PBS清洗，用胰蛋白酶消化，收集细胞，1500 r/min离心5 min。去上清液，加入5 ml 0.075 mol/L的KCl，低渗25 min。缓慢加入1 ml新配的预冷卡诺固定液，固定15 min。1500 r/min离心5 min，弃上清液，重复此步骤3次。冷滴片法滴片(Freshney，2010)，待载玻片干燥后，用5%吉姆萨染液染色25 min，干燥镜检，随机统计100个细胞分裂相的染色体数目(Levan et al，1964)。
1.2.4 GCO细胞系对SVCV的敏感性分析
1.2.4.1病毒生长曲线
准备足够的GCO细胞，用胰蛋白酶消化后，加入新鲜的细胞培养液。测定细胞浓度，稀释至105 cell/ml。在9个12.5 cm2的细胞瓶中，接入3 ml GCO细胞悬液。24 h后接种300μl滴度为103 TCID50/50μl的SVCV悬液，置于20℃下培养。每隔24 h，取3瓶，反复冻融3次，用细胞培养液进行10倍系列稀释，待用。在96孔板中，接种新鲜的GCO细胞，测定每瓶细胞中SVCV的滴度。根据Yan等(2011)的方法，绘制20℃时SVCV在GCO细胞中的生长曲线。
1.2.4.2 GCO细胞系和其他常用鱼类细胞系对SVCV易感性的比较
SVCV在不同细胞内滴度测定：在4个25 cm2的细胞瓶中，分别准备GCO、EPC、FHM和CHSE-214细胞系。在各细胞系最适培养温度下培养24 h后，接种500μl滴度为103 TCID50/50μl的SVCV悬液，置于20℃培养，每天观察是否出现细胞病变效应(CPE)。待CPE完全后，反复冻融3次。准备新鲜的EPC细胞用于病毒滴度的测定。
SVCV诱导不同细胞凋亡情况分析：根据Riccardi等(2006)的方法，分别将GCO、CHSE-214、EPC和FHM细胞转至6孔板中。24 h后，每孔接种100μl滴度为103 TCID50/50μl的SVCV悬液，并设置空白对照，置于20℃培养箱中培养48 h。用胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液，用冰PBS洗涤细胞2次，弃上清液。用试剂盒中的1×结合缓冲液重悬细胞，细胞浓度达到1×106-1×107 cell/ml。每个实验管中加入10μl Annexin V-FIT，轻柔涡旋震荡，避光冰置15 min，然后加入380μl冰冷的1×结合缓冲液，再加入10μl碘化丙啶(PI)，用于之后仪器分析。
1.2.4.3电镜观察SVCV感染GCO细胞
用SVCV病毒感染单层GCO细胞，在CPE出现明显时，收集细胞。1500 r/min离心10 min，用PBS洗涤2次后，用含2.5%戊二醛的PBS(0.1 mol/L，pH为7.2)固定过夜。再用PBS洗涤细胞，用1%四氧化锇固定90 min后，最后用PBS洗涤2次。用梯度浓度的乙醇脱水，树脂包被，超微切片机(Reichert-Jung)超薄切片，用透射电镜(JEOL JEM-1000CX II，日本)观察(100 kV)。
2结果与分析
2.1 GCO细胞系特性
2.1.1生长特性
GCO细胞系是从草鱼性腺组织分离建立的连续细胞系，呈上皮样形态，细胞间存在接触抑制，无重叠生长(图1)。从GCO细胞的生长曲线(图2)可以看出，25℃最适宜GCO的生长。GCO在贴壁生长后，第1天生长较慢，第2天生长开始加快，进入对数生长期，持续3 d左右后进入平台期。
图1培养3 d的GCO(100×)
图2 GCO在不同温度下的生长曲线
2.1.2细胞周期
应用流式细胞仪对第345代的GCO细胞进行细胞周期检测，发现GCO核型正常，为二倍体(图3)。GCO在G1期的DNA含量占88.03%，在S期的DNA含量占1.78%，表明GCO增殖活力旺盛。
图3第345代GCO细胞生长周期
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