Y群脑膜炎奈瑟菌对13种抗菌药物敏感性试验——摘要、材料与方法
摘要
目的了解海南省Y群脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis,Nm）流行病学、分子特征及对抗菌药物的敏感性，为Y群流行性脑脊髓膜炎（流脑）的预防控制和治疗提供科学依据。方法对海口市2022年5月发现的2例流脑病例患者血液标本和密切接触者咽拭子进行脑膜炎奈瑟菌分离培养、生化和普通聚合酶链反应种属鉴定，将得到的Nm用玻片凝集法和荧光聚合酶链反应进行血清分群和基因分群；用二代全基因组测序技术对7株Nm进行全基因组测序；用E-test试纸条法进行13种抗菌药物敏感性试验。结果2例患者都是青少年。从患者和密切接触者中共获得7株Nm分离株，其中2株来自患者，5株来自密切接触者。7株Nm血清分群结果与基因分群结果一致，均是Y群Nm。所有分离株基因序列GC含量在51.84%~51.86%，序列型是ST-1655型，属于ST-23克隆群。外膜蛋白porA（P1.5-1,10-1）、porB（3-117）和fetA（F4-1）基因分型结果均一致。7株Nm的耐药相关基因序列完全相同。所有菌株对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、美罗培南、氯霉素、阿奇霉素、米诺环素、利福平、环丙沙星、萘啶酸、左氧氟沙星敏感，对复方新诺明耐药。结论海南省已发现ST-1655型血清Y群Nm感染病例，应加强该地区流脑菌群监测，推广流脑ACWY群四价疫苗接种，防止Y群流脑发病和死亡。
流行性脑脊髓膜炎（epidemic cerebrospinal meningitis，ECM）简称流脑，是由脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis,Nm）引起的急性呼吸道传染病，具有起病急、病情发展快和病死率高等特点。人是脑膜炎奈瑟菌唯一宿主，多数人感染后表现为隐性感染，少数人会引起流脑或侵袭性菌血症。Nm根据荚膜多糖结构可分为12个血清群（A、B、C、X、Y、Z、E、W、L、H、I和K），其中A、B、C、X、Y和W是导致人类疾病常见的血清群。目前全球面临多个血清群Nm流行和变迁威胁。我国近年A群、C群病例明显减少，B群、W群、Y群病例呈增加趋势。2022年5月海南省确诊2例Y群流脑病例，并从流脑患者全血和密切接触者咽拭子中分离到了7株Nm，现将其流行病学、分子特征和药敏结果报告如下。
1材料与方法
1.1标本资料
病例1，男，19岁学生，天津市人，居住海口市琼山区，2022年5月25日发病，26日采集全血样本送检，5月27日采集与患者密切接触者（密接者）80份咽拭子现场接种双抗巧克力平板送检。病例2，男，15岁辍学学生，海南屯昌人，居住海口市龙华区，5月9日发病，5月27日采集全血培养瓶送检。6月2日采集与患者密切接触者57份咽拭子现场接种双抗巧克力平板送检。
1.2主要试剂与仪器
血平板、普通巧克力平板、双抗平板（广东环凯）；细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）试剂盒（德国QIAGEN公司）；Nm双重核酸、Nm（A型、B型、C型）和Nm（X型、Y型、W135型）三重核酸检测预分装试剂盒（深圳市生科源）；NH奈瑟菌鉴定卡（法国生物梅里埃）；兔抗脑膜炎球菌诊断血清试剂（青岛中创汇科）；羊血M-H平板（广州迪景）；13种抗菌药物E-test纸条（意大利liofilchem公司）。Nm基因组测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。仪器：二氧化碳（CO2）培养箱（德国Memmert公司）；ABI 7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；Tpersonal PCR仪（德国Biometra公司），Gel Doc XR+凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。
1.3方法
1.3.1病原学检测
将病例1全血、病例2血液培养瓶标本接种的血平板、巧克力平板和病例1的80份、病例2的57份密接者咽拭子双抗平板，置5%CO2，36.5℃培养24~48 h。取疑似菌分纯后做氧化酶试验，VITEK 2 NH奈瑟菌生化鉴定。密接者分离株用普通聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）进行Nm种属鉴定。确定为Nm的菌株用脑膜炎奈瑟菌诊断血清进行玻片凝集试验，基因分群使用商品化试剂盒荧光PCR扩增Nm荚膜转运基因（ctrA基因）、铜-锌超氧化物歧化酶基因（sodC基因）和A、B、C、W、X、Y群特异性基因。
1.3.2全基因组测序
提取基因组DNA，按QIAamp DNA Mini Kit说明书操作，每株菌提取4管，每管100μL送上海生工进行二代全基因组高通量测序，要求：基因组覆盖度≥95%，基因区覆盖度≥98%，整体覆盖度≥100X，Scaffold个数<100个，Contig数量<200个，单碱基错误率低于1/105。测序质量控制：PE150及以上测序，原始数据量（碱基数）≥1.5 G，高质量测序数据（Q20）≥1 Gb，Q30比例≥85%。最终获得拼接好的全基因组框架图序列。将基因组框架图序列上传PubMLST网络数据库（https://pubmlst.org/neisseria）进行在线分析，获得菌株序列型（sequence type,ST）、克隆群（clone complex,CC）、耐药基因、疫苗相关蛋白基因以及外膜蛋白基因porA（包括可变区VR1和VR2）、porB和fetA的基因型和亚型。Nm基因亚型书写按“血清群:porA VR1基因型，VR2基因型:fetA基因型:ST型（克隆群）”。
1.3.3药物敏感性试验
参考2019年美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的《抗微生物药敏试验执行标准》，采用微生物快速药敏监测系统测定Nm菌株对13种抗菌药物的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）。经鉴定的脑膜炎奈瑟菌接种巧克力平板36℃，5%CO2培养22 h，取菌落用3 mL灭菌生理盐水制备浓度为0.5麦氏单位的菌液，直接涂布羊血M-H平板，每个M-H平板只能贴1根E-test试纸条，置36℃，5%CO2培养22 h后读取MIC值，试验同时用ATCC49619和ATCC25922做质控。结果判定按2019年CLSI推荐标准报告。
Y群脑膜炎奈瑟菌对13种抗菌药物敏感性试验——摘要、材料与方法