GR基因缺失对溶藻弧菌生物学特性及抗生素敏感性的影响（三）
2.3缺失株△gr遗传稳定性
图3表明，缺失株△gr经连续传30代后，仍可准确扩增出gr基因上下游融合片段，表明所构建缺失株△gr的遗传信息可在子代中稳定地传递。
图3溶藻弧菌缺失株△gr稳定性检验
2.4生长曲线
在TSB培养基中培养的溶藻弧菌野生株HY9901和缺失株△gr所得到的生长曲线见图4。图4可见，缺失株△gr生长情况与HY9901一致，即敲除gr基因对溶藻弧菌生长无明显影响。
图4溶藻弧菌野生株HY9901和缺失株△gr的生长曲线
2.5药敏实验
溶藻弧菌缺失株△gr对四环素、克林霉素和呋喃唑酮等药敏实验结果如表2所示。表2可见，缺失株△gr对四环素、克林霉素和呋喃唑酮等耐药性减弱。
表2药敏实验抑菌圈直径
2.6生物膜
图5可见，培养24 h的野生株和缺失株的生物膜形成能力差异显著（P＜0.05），与野生株相比，缺失株△gr的生物膜显著增厚。
2.7泳动能力
培养12 h后野生株和缺失株的泳动能力如图6所示。结果表明gr基因的缺失显著减弱了溶藻弧菌的泳动能力（P＜0.01）。
图5溶藻弧菌野生株HY9901和缺失株△gr生物膜形成能力
图6溶藻弧菌野生株HY9901和缺失株△gr的泳动能力
2.8胞外蛋白酶活性
胞外蛋白酶作为细菌释放于环境中的代谢物，包含有酪蛋白酶、溶血素、明胶酶、淀粉酶和铁载体等多种活性物质，是致病菌的主要毒力因子之一。与野生株相比，缺失株△gr的胞外蛋白酶活性显著降低（P＜0.01）（图7）。
图7溶藻弧菌野生株HY9901和缺失株△gr胞外蛋白酶活性
3讨论
在生物体氧化还原代谢的过程中，GR为一种极其重要的抗氧化酶，对清除细胞内ROS，维持细胞内稳定的氧化还原状态有重要作用。学界正不断深入研究GR在生物体发育、疾病防御、抗非生物胁迫及氧化应激等方面的作用。
为更好了解gr基因在溶藻弧菌抗氧化中的作用，本研究敲除溶藻弧菌gr基因，缺失株△gr遗传信息可在子代中稳定地传递。与野生株相比，缺失株△gr的生长趋势变化不大，这可能是因为gr基因的缺失对其摄取与消化营养物质几无影响，也可能因为二菌株受环境胁迫较少。
抗生素可抑制细菌生长繁殖或杀死细菌，多由细菌自身合成的化学物质，可杀死周围环境的其他微生物来维持细菌体内平衡，通过阻碍细菌细胞壁合成、增强细菌细胞膜通透性、抑制蛋白质合成、阻碍细菌DNA复制和转录而发挥抗菌作用。目前，使用抗生素仍是控制弧菌病的主要手段，但滥用抗生素会导致耐药菌的出现。研究表明，抗生素刺激细菌会产生氧化应激，使细胞内产生大量的活性氧和自由基，破坏细胞内的氧化还原平衡，引起细胞的损伤。因此，本研究中，溶藻弧菌在敲除gr基因后，其对四环素、克林霉素和呋喃唑酮等敏感性提高，可能由缺失株的清除活性氧能力减弱所致。
生物膜的形成是微生物之间通过协同作用形成的一种生存策略，也是微生物适应复杂多变的生存环境和抵御不良环境因素的重要手段。研究表明，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的生物膜形成与活性氧（ROS）的增加相关。本研究中，缺失株△gr的生物膜出现增厚现象，推测溶藻弧菌在敲除gr基因后，细菌内的氧化应激水平提高，使生物膜形成得以进一步增强，从而抵御不良的环境因素。
鞭毛是细菌表面重要的附属结构，对其泳动能力有直接影响。本研究中，与野生株相比，缺失株△gr的泳动能力显著减弱，推测gr基因的缺失可能对鞭毛的产生或运动造成一定的影响，进而减弱缺失株的泳动能力，但泳动能力变化机制还需进一步研究。
细菌的毒力因子与其致病性有紧密的关系，胞外蛋白酶是细菌主要的毒力因子，不仅通过消化为细菌的生长供应必要的营养物质，还可直接对宿主的免疫防御系统造成破坏。本研究中，gr基因的缺失使溶藻弧菌的胞外蛋白酶活性显著降低，缺失株△gr毒力可能减弱，推测gr基因可能在其胞外蛋白酶的分泌或活性等方面有一定作用。
4结论
本研究成功构建gr基因缺失株△gr。与溶藻弧菌野生株HY9901比较，该缺失株对四环素、克林霉素和呋喃唑酮等耐药性减弱，生物膜形成能力显著增强，胞外蛋白酶活性显著降低，泳动能力显著减弱。因此，GR在溶藻弧菌的毒力、生物膜形成、药物敏感性、泳动等方面有重要作用。
相关新闻推荐
1、孢汉逊酵母、美极梅奇酵母等菌株生长曲线测定及酿酒因子耐受性分析（二）
2、双歧杆菌分离鉴定、耐受性试验、益生特性试验及安全性评价（一）