KLK5过表达促进宫颈癌移植瘤生长曲线并降低顺铂化疗敏感性的实验研究（一）
摘要：
目的探讨激肽释放酶5（KLK5）过表达对宫颈癌细胞的增殖、侵袭及顺铂（DDP）敏感性的影响，并阐明其作用机制。方法采用Western blotting法验证KLK5稳定转染过表达的宫颈癌细胞（ME180-OE-KLK5）。取对数生长期的宫颈癌ME180-NC-KLK5和OE-KLK5细胞，分别将其接种于裸鼠皮下建立皮下移植瘤模型，造模成功后裸鼠随机分为生理盐水对照组（NC-KLK5+0.9%NaCl组）、DDP治疗组（NC-KLK5+DDP组）、KLK5过表达组（OE-KLK5+0.9%NaCl组）和KLK5过表达联合DDP组（OE-KLK5+DDP组），每组5只。NC-KLK5+DDP组和OE-KLK5+DDP组裸鼠按照5 mg·kg-1的比例腹腔注射DDP；NC-KLK5+0.9%NaCl组和OE-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠按照0.01 mL·g-1的比例腹腔注射生理盐水。每2 d称裸鼠质量，并记录瘤体的长径和短径，计算肿瘤体积，绘制瘤体生长曲线，于第14天给药结束后24 h，处死裸鼠，剥离瘤体并称质量。采用HE染色法观察各组裸鼠肿瘤组织病理形态表现，免疫组织化学染色法观察各组裸鼠肿瘤组织中KLK5、Ki67和基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白表达水平。结果与ME180-NC-KLK5细胞比较，ME180-OE-KLK5细胞中KLK5蛋白表达水平升高（P<0.05）。
皮下移植瘤种植后第1周，各组裸鼠进食和活动状态良好，体质量逐渐增长。第2周开始进入给药阶段，NC-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠进食和活动状态及体质量较第1周无明显变化；与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，NC-KLK5+DDP组裸鼠开始出现食欲减退，体质量不增长，活动状态减弱；第3周药物治疗期间，NC-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠进食及活动状态较第2周无明显变化，开始出现体质量不增长；与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，NC-KLK5+DDP组裸鼠进食和活动状态明显减弱，体质量降低。与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，NC-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤体积减小（P<0.01）；与NC-KLK5+DDP组比较，OE-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤体积明显增大（P<0.001）；与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠移植瘤体积增大（P<0.001）；与OE-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤体积差异无统计学意义（P>0.05）。与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，NC-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤质量降低（P<0.05）；与NC-KLK5+DDP组比较，OE-KLK5+DDP组裸鼠瘤质量明显升高（P<0.001）；与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠瘤质量升高（P<0.001）；与OE-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+DDP组裸鼠瘤体质量差异无统计学意义（P>0.05）。
与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠移植瘤细胞核异质性更强；OE-KLK5+DDP组和NC-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤细胞出现形态学改变，表现为细胞核固缩、碎裂，肿瘤细胞体积缩小以及出现坏死和凋亡等。与NC-KLK5+DDP组比较，OE-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤坏死程度更明显。与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，NC-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤组织中KLK5、Ki67和MMP-9蛋白表达水平降低（P<0.05）；与NC-KLK5+DDP组比较，OE-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤组织中KLK5、Ki67和MMP-9蛋白表达水平升高（P<0.001）；与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠移植瘤组织中KLK5、Ki67和MMP-9蛋白表达水平升高（P<0.001）；与OE-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤组织中KLK5、Ki67和MMP-9蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。
结论KLK5过表达可促进DDP处理的宫颈癌ME180细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，上调移植瘤组织中Ki-67和MMP-9蛋白表达，降低移植瘤对DDP的敏感性。
宫颈癌是全球女性第4大常见癌症，其发病率和死亡率在女性恶性肿瘤中均位居前列。化疗是宫颈癌系统性治疗的核心手段，在宫颈癌的治疗中具有不可替代的地位。顺铂（cisplatin，DDP）是宫颈癌的一线化疗药物，广泛应用于宫颈癌的同步放化疗、辅助治疗以及姑息治疗。化疗耐药性是宫颈癌临床治疗效果不佳的主要原因，降低了患者有效生存时间。激肽释放酶（kallikreins，KLK）家族由15个高度同源的分泌型丝氨酸蛋白酶基因组成，其中KLK5的异常表达和功能失活与癌症的发生发展及预后有密切关联。KLK5在不同肿瘤中的表达水平及其功能存在明显差异，其在基底细胞样乳腺癌和高级别浆液性卵巢癌中表达明显上调，而在前列腺癌和阴道癌中则下调或表现出潜在抑制作用，提示其功能具有组织环境依赖性。KLK5在肿瘤中的作用具有组织特异性和肿瘤类型特异性，有望作为癌症诊断的生物标志物和潜在治疗靶点。已有研究证实KLK5增强了宫颈癌放疗的辐射抗性，但对于KLK5在宫颈癌化疗中的作用机制及相关影响因素的研究较少，尚无明确结论。本研究探讨KLK5过表达对宫颈癌细胞增殖、侵袭和DDP敏感性的影响，通过建立宫颈癌OE-KLK5细胞皮下移植瘤裸鼠模型，观察KLK5过表达对皮下移植瘤生长及化疗敏感性的影响，为宫颈癌的临床治疗提供新思路。
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