多杀性巴氏杆菌分离鉴定、分型、药敏试验及小鼠致病性试验（三）
2.3多杀性巴氏杆菌PFGE分子分型
34株Pm中有1株暂不能分型，其余菌株的DNA指纹图谱用BioNumerics 7.6软件聚类分析，根据Tenover等制定的标准将33株分离株分为21个带型(图3)，Pm菌株的谱型具有明显的多样性。A族谱型的菌株较多，亲缘关系较近；Pm2、Pm3和Pm4分离于同一地区的同一养殖场，且不同的分型结果均一致，为同一克隆株，且遗传稳定。其中，Pm2与Pm46为来自不同地区的两株分菌株，荚膜、脂多糖基因型均相同，PFGE将其进一步区分，二者相似度为95.2%，菌株间存在差异性，但其具有相近的亲缘关系，表明其流行范围广。
注：根据85%相似性得到A族菌株最多，为5株，红色框为A族菌株
图3猪源多杀性巴氏杆菌PFGE聚类和MLST分型结果
2.4多杀性巴氏杆菌MLST分型
34株Pm鉴定出ST3、ST10、ST11、ST12、ST35、ST117、ST134和ST146 8种ST基因(图3)，所占比例分别为17.65%、17.65%、35.29%、2.94%、2.94%、17.65%、2.94%、2.94%，ST11为优势序列型。通过PHYLOVIZ 2.0对MLST结果进行聚类分析(图4)，34株Pm分布在一个克隆群，ST3型菌株主要为A:LPS3；ST10型菌株均为A:LPS6；ST11型菌株主要为D:LPS6；ST12型菌株主要为F:LPS3；ST35型菌株为A:LPS3；ST117型菌株均为A:LPS6(50%)；ST134型菌株为D:LPS6；ST146型菌株为D:LPS6。
图4 MLST聚类结果
2.5多杀性巴氏杆菌耐药性
微量肉汤稀释法测定34株Pm的MIC分析热图(图5A)，34株菌株对多黏菌素B和四环素耐药率分别为38.23%和35.29%；氟苯尼考的耐药率为23.53%；环丙沙星耐药率为8.82%；氯霉素的耐药率为14.71%；头孢噻呋的耐药率为11.76%；卡那霉素的耐药率为2.94%(图5B)。34株Pm菌株中14株对两种以上的抗菌药物耐药，其中3株Pm菌株对三种及三种以上的抗菌药物呈现耐药，分别为Pm-LN5、PmD1和PmD2。
A.耐药性分析热图；B.34株Pm耐药性情况统计
图5多杀性巴氏杆菌耐药性结果
2.6多杀性巴氏杆菌耐药基因检测
Pm二代测序组装的基因组与GenBank中的Pm全基因组大小一致，约为2.3 Mb。将组装后的基因组进行耐药基因检测，共检出9种耐药基因(表2)，分别为四环素类药物的耐药基因tet(B)，tet(C)和tet(L)；氟苯尼考和氯霉素的耐药基因floR；链霉素和大观霉素的耐药基因aadA14；磺胺甲噁唑的耐药基因sul2；链霉素的耐药基因aph(6)-Id和aph(3″)-Ib；卡那霉素和新霉素的耐药基因aph(3′)-Ia；四环素类药物耐药基因检出率为29.41%(10/34)，耐药基因谱型与耐药表型测定结果符合率较高Pm50、Pm226、Pm241等菌株均具有耐四环素类药物的耐药基因，MIC结果显示耐药；氟苯尼考和氯霉素耐药基因检出率为20.69%(7/34)，但耐药表型与基因型存在不符的情况，Pm-LN5、Pm-JL和Pm267存在floR基因，MIC结果显示敏感。
表2多杀性巴氏杆菌耐药基因检测结果
2.7毒力试验结果
猪源Pm荚膜A型菌株较D型菌株毒力强。PmA1组小鼠攻毒后精神萎靡，被毛凌乱无光泽，眼睑水肿，双眼分泌物增多，部分小鼠呼吸急促，12 h时腹腔注射菌液浓度为787.5和157.5 CFU·mL-1的小鼠全部死亡，3 d内31.5 CFU·mL-1的小鼠全部死亡。PmD4组12 h时6.3×107 CFU·mL-1小鼠全部死亡，6.3×106和6.3×105 CFU·mL-1两个梯度的小鼠陆续死亡，6.3×104 CFU·mL-1小鼠未死亡；PBS组小鼠均存活。剖检死亡小鼠可见心、肺、肝组织边缘出血；脾组织淤血；肝有白色坏死灶；肠道内容物稀薄，呈胶冻样。无菌采取肺、肝组织接种于加有5%绵羊血的TSA平板培养后，菌落形态单一，与病原分离菌一致，挑取单个菌落经kmt基因鉴定为多杀性巴氏杆菌。
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