基于超微药粉琼脂稀释法检测9种致病菌对常用15种中药的敏感性（一）
细菌性传染病是水产养殖动物的主要疾病之一，对水产养殖的危害最严重，常导致养殖鱼类的大量死亡，造成巨额经济损失。致病菌对抗菌药物的耐药性程度和频率越来越高，筛选高效的抗菌药物仍然是治疗细菌性传染病的最主要方法。在测试致病性细菌对某一药物的敏感性时，常用的方法有滤纸片法、牛津杯法、试管二倍稀释法、平板二倍稀释法。目前，这四种检测方法存在操作繁琐、工作量大、周期长、培养条件不一致等问题，不能快速地确定致病菌株对各药物的敏感性。尤其在初步筛选抗菌中药时，植物药材种类繁多，每种药材预先要粗提其有效部位，并去除萃取溶剂，操作程序更复杂、耗时更长。
本研究目的是为了建立针对多株致病菌可同步进行初筛抗菌中药的一种快速简便的药敏实验方法。首先利用超微粉碎机将15种植物药材粉碎成微米级颗粒（5～10μm），可提高药材中抑菌成分的有效溶出；随后将超微药粉添加到M-H营养琼脂培养基内制成系列药物浓度的固体平板，再接种9株致病菌于同一琼脂平板上进行药敏实验，24 h培养后观察供试菌的菌落生长情况，以无菌落形成的最低浓度为该中药的最低抑菌浓度（MIC），该方法定名为超微药粉琼脂稀释法。
1材料和方法
1.1药材与试剂
五倍子（Galla Chinensis，缩写GC，产地湖北）；石榴皮（Pomegranate Rind，缩写PR，产地安徽）；大黄（RhubarbOfficinale，缩写RO，产地甘肃）；黄芩（Baical Skullcap Root，缩写BSR，产地河北）；虎杖（Rhizoma Polygoni Cuspidati，缩写RPC，产地福建）；黄连（Golden Thread，缩写GT，产地四川）；连翘（Weeping Forsythia Capsule，缩写WFC，产地江西）；知母（Common Anemarrhena Rhizome，缩写CAR，产地河北）；首乌藤（Caulis Polygoni Multiflori，缩写CPM，产地江苏）；地榆（Radix Sanguisorbae，缩写RS，产地福建）；贯众（Dryopteris Setosa，缩写DS，产地四川）；金银花（Flos Lonicerae，缩写FL，产地辽宁）；紫花地丁（Purpleflower Violet，缩写PV，产地河南）；马齿苋（Portulaca Oleracea Linn，缩写POL，产地福建）；苦楝皮（Cortex Meliae，缩写CM，产地四川），均购自国药控股福建有限公司；标准肉汤培养基（Mueller-Hinton Broth，M-H），购自广东环凯微生物科技有限公司。
1.2菌株
9株鱼类致病菌均为本研究室从漳浦、莆田、龙岩、福清等养殖场病鳗中分离得到，并经人工感染实验证实为致病菌，同时菌株进行生理生化和基因鉴定，分别确定为气单胞菌属（Aeromonas sp.）B01、B19、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）B14、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B10、B15、B18、B20、B27、肠棕气单胞菌（Aeromonas enteropelgenes）B09。
1.3菌悬液制备
从保种斜面上挑取菌苔划线接种M-H琼脂（Mueller-Hinton Agar）平板，置于28℃恒温培养箱内培养20 h；挑取单个菌落划线至新鲜斜面上，28℃培养24 h后，用无菌生理盐水将菌体冲洗下来，采用酶标仪测定菌液浓度，测定波长为600 nm。采用菌落计数法确定细菌密度与吸光度OD600的关系数，不同菌株的菌液OD600值约为0.2～0.3时，对应活菌计数值约为108CFU/ml，将菌液浓度稀释10倍调至107CFU/ml，即可作为药敏实验接种的菌悬液。
1.4中药高压水提液的制备
称取50 g的中药超微粉，加蒸馏水300 ml置于20 kHz超声处理40 min后，置于高压灭菌锅中煎煮（110℃、10 min，95℃、30 min）提取，然后用50 ml离心管分装，用冷冻离心机8 000 r/min离心10 min，取上清液，放置4℃冰箱保存备用。
1.5超微药粉或药液琼脂稀释药物敏感实验
在M-H培养基添加超微粉碎的中药粉末或者高压水提的药液，以浓度6 g/ml和1 g/ml开始进行二倍稀释，配置不同浓度梯度的药敏培养基。取9种已稀释好的107CFU/ml菌液各2μl点种在经过121℃、20 min灭菌后的同一个药敏培养基平板上，每个药物浓度梯度做3组平行。将接种好的平板放置28℃培养，24 h后观察供试菌的菌落生长情况，以无菌落形成的最低浓度为中药的最低抑菌浓度（MIC）。
1.6纸片法的药物敏感实验
首先用无菌蒸馏水将高压水提的药液进行二倍稀释，配置不同浓度梯度的实验药液；用打孔器将滤纸打成直径为6 mm的圆纸片，经121℃高压灭菌30 min，将此无菌滤纸片分别浸入药液中，充分浸泡6 h后，用无菌镊子移至无菌试管中，再滴加50μl药液放在37℃干燥箱中烘干制成饱和的药敏纸片；取已配制成107CFU/ml的菌悬液100μl均匀涂布于90 mm琼脂平板上，将饱和的药敏纸片贴于琼脂平板表面，每皿贴5片不同浓度药敏纸片，于28℃恒温培养箱中培养24 h后，测量其抑菌圈直径。每个浓度的药物平行重复测试3次，判断致病菌对药物的敏感度。
2结果
2.1超微药粉琼脂稀释法测定中药对致病菌的抑制作用
选常用15种中药，采用本研究建立的超微药粉琼脂稀释法，检测9株不同种属的致病菌对它们的敏感度，从中筛选出抗菌活性高的药材，为今后进一步研制抗菌渔药提供参考（见表1）。从表1的实验结果可见，五倍子的抑菌效果最佳，其次是首乌藤、地榆，再次为石榴皮、贯众、大黄、黄芩、虎杖，其余中药的抑菌效果极差。B01、B27对五倍子极度敏感，其余7株菌为高度敏感；除B19、B20对首乌藤显示中度敏感外，其余7株菌均表现为高度敏感；B10对地榆显示低度敏感，B01、B14、B27为中度敏感，B09、B15、B18、B19、B20均为高度敏感；B15、B18、B19、B20、B27对石榴皮显示中度敏感，仅B01、B09表现高度敏感，B10显示低度敏感，而B14显现不敏感；B20对贯众不敏感，B09、B27显示低度敏感，B10、B14、B15、B19显示对贯众中度敏感，B01、B18对贯众显示高度敏感；除B01、B10、B15对大黄中度敏感外，其余均为低度敏感；9株致病菌对黄芩均呈现低度敏感。9株致病菌对虎杖的敏感性差异很大，B01、B10、B14、B18表现为高度敏感，但除B01对苦楝皮和黄连均中度敏感外，其余菌株均不敏感。
表1超微药粉琼脂稀释法测定各种中药的最低抑菌浓度（mg/l）
相关新闻推荐
1、大肠杆菌噬菌体Bp4抗性菌株与其敏感菌株培养特性及耐药性检测（一）