摄入末水条斑紫菜改变肠道菌群组成并增加结肠丁酸含量
1.2.2动物处理
试验结束时用注射乌来糖的方式麻醉小鼠,脱颈处死后取小鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠组织于组织固定液中待检,收集结肠内容物并于-80℃保存待检。
1)组织病理学观察。取小鼠结肠组织用4%多聚甲醛固定,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,将石蜡块切成3μm厚的切片,随后依次进行切片脱蜡、切片复水、油红O染色、甘油明胶封片,使用光学显微镜观察结肠组织的形态并拍照。
2)肠道短链脂肪酸测定。参考Chen等的方法,采用气相色谱法测定短链脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA)含量,并稍作修改。将乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸分别用去离子水稀释配制成1.00 mol·L-1的单标母液;正戊酸、异戊酸分别用去离子水稀释配制成200.00 mmol·L-1的单标母液。分别吸取一定体积的SCFA单标溶液混合,配制成系列梯度的混标溶液,其中乙酸、丙酸和正丁酸的浓度梯度为50.00、25.00、12.50、6.25、1.56、0.78和0.39 mmol·L-1;异丁酸、异戊酸和正戊酸的浓度梯度为5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.08和0.04 mmol·L-1。将浓度为25.00 mmol·L-1的2-乙基丁酸溶液作为内标(通过0.20 mol·L-1HCl配制)。吸取150μL混标溶液与150μL内标溶液充分混匀,过0.22μm滤膜后转移至上样瓶中。称取50～75 mg的小鼠粪便于离心管中,随后加入5倍体积的蒸馏水稀释,涡旋20 min后浸泡过夜,充分萃取。将粪便悬浊液于12 000 r·min-1离心5 min,取150μL上清液加入等体积内标,充分涡旋混合后过0.22μm滤膜,使用配有HP-INNOWAX毛细管柱与火焰离子化检测器(FID)的Agilent 6890N气相色谱仪测定。测定条件:空气、氮气和氢气的流速分别为260、30和30 mL·min-1;柱温设定为程序升温,初始100℃柱温保持1 min,随后以5℃·min-1速度升高温度至180℃,并在180℃下保持4 min;进样器和检测器的温度均为250℃。以SCFA混标梯度溶液绘制标准曲线,根据标准曲线计算小鼠结肠内容物中SCFA的含量。
3)肠道菌群高通量测序。为了探究不同剂量末水条斑紫菜对正常小鼠肠道菌群结构的影响,分别对对照组(C1、C2、C3)、低剂量组(L1、L2、L3)、高剂量组(H1、H2、H3)小鼠结肠内容物样品进行16S rDNA基因测序分析。使用携带Barcode序列的上游引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和下游引物806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')对16S rRNA基因V3—V4可变区进行PCR扩增。样品DNA的抽提、高通量测序文库的构建和基于Illumina PE300/PE250平台测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
1.3数据处理
采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析处理数据,各组以变异数ANOVA进行比较分析,采用LSD法进行多重比较。数据均采用平均数±标准误((-overx)±SE)表示,采用Origin 2023b软件绘图。
16S rDNA测序的数据分析均在美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com)上进行,具体方法:利用mothur软件计算Alpha多样性指数Chao 1、Shannon以及Simpson指数;采用R语言工具根据不同分组在门水平、属水平上的物种组成情况绘图,并且根据样本间丰度的相似程度进行聚类,将结果呈现在群落heatmap图上。
2结果与分析
2.1末水条斑紫菜对小鼠生长性能的影响
如表1所示:各组小鼠始重均在23 g左右,说明分组较为均匀,且无显著性差异(P>0.05)。喂养28 d,未摄入末水条斑紫菜的小鼠体重达24.66 g,低剂量摄入组小鼠体重达24.52 g,高剂量摄入组小鼠体重达25.21 g,各组小鼠末重无显著性差异。此外,对照组、低剂量组和高剂量组小鼠的平均日采食量(ADFI)与平均日增重(ADG)均无显著性差异。这表明末水条斑紫菜的摄入对小鼠的生长性能无明显影响。
表1末水条斑紫菜对健康小鼠生长性能的影响
2.2末水条斑紫菜对小鼠结肠组织的影响
如图1所示:对照组小鼠结肠组织长度为(53.50±1.88)mm,经灌胃末水条斑紫菜处理后,低剂量组小鼠结肠组织长度为(65.60±3.39)mm,高剂量组小鼠结肠组织长度为(57.30±1.39)mm。低剂量组小鼠结肠组织长度显著长于对照组和高剂量组(P<0.05),高剂量组小鼠结肠比对照组长,但是无显著性差异。各组小鼠结肠组织切片HE染色病理图如图2所示,对照组小鼠的结肠组织结构清晰,低剂量组与高剂量组黏膜光滑完整,黏膜层细胞排列有序,无明显的炎细胞浸润现象,且杯状细胞数量较对照组增多。
2.3末水条斑紫菜对小鼠结肠内容物中短链脂肪酸含量的影响
如图3所示:与未摄入末水条斑紫菜的小鼠相比,摄入低剂量和高剂量的末水条斑紫菜小鼠结肠内容物中乙酸、丙酸、正戊酸、异戊酸的含量没有显著性差异。但是,摄入高剂量的末水条斑紫菜的小鼠结肠内容物中正丁酸和异丁酸含量显著高于对照组。并且,低剂量组末水条斑紫菜也能够显著增加结肠内容物中异丁酸含量。
2.4末水条斑紫菜对小鼠肠道菌群多样性的影响
采用16S rDNA测序方法分析小鼠肠道菌群的组成。各组小鼠肠道菌群的Alpha多样性指数如表2所示,与对照组相比,低剂量组Chao1指数无显著性差异,高剂量组Chao1指数显著低于对照组,这表明高剂量组小鼠肠道菌群所含物种显著少于对照组。对照组、低剂量组和高剂量组的Shannon指数均无显著性差异(P>0.05)。低剂量组与高剂量组小鼠肠道菌群Simpson指数均显著高于对照组,这说明低剂量组与高剂量组小鼠肠道菌群物种丰富度较低。
各组小鼠肠道菌群物种Venn图见图4。3组小鼠肠道菌群测序共得到1 034个OTU,3组样本共有的OTU数为398个。对照组的OTU数最多,达到815个,特有OTU数287个。灌胃低剂量末水条斑紫菜组OTU总数为651个,特有OTU数109个。灌胃高剂量末水条斑紫菜组OTU总数为543个,特有OTU数61个。这说明末水条斑紫菜的摄入减少了肠道菌微生物的种类。
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