水产养殖迟钝爱德华氏菌生长曲线及对链霉素敏感性检测（一）
摘要:为了建立一种可以应用于水产养殖现场的药敏快速检测方法，以迟钝爱德华氏菌JF-1为试验菌株，在MHB培养基基础上通过添加鱼肉蛋白胨及调节无机盐离子浓度，优选了迟钝爱德华氏菌的增菌液，在此基础上利用阿尔玛蓝作为细菌生长指示剂，选择11种水产常见药物并设置了8个倍比稀释的质量浓度梯度，制备了迟钝爱德华氏菌快速药敏检测微孔板，板内设有药敏检测区、生长对照区及空白对照区。经显色法及分光光度法药敏检测试验结果比对，选定1x10°个/mL菌液密度作为快速药敏检测的接菌密度，将该密度菌液接种于制备的快速药敏检测微孔板进行药敏检测，同时以分光光度法及试管稀释法检测结果作为比对，结果显示在接种12h后，显色法测定的所有药物对菌株JF-1的最小抑菌质量浓度与分光光度法完全吻合，但与接种24h后观察的稀释法在氨苄青霉素和复方新诺明两种药物的最小抑菌质量浓度上存在微小偏差。试验结果显示，本研究建立的迟钝爱德华氏菌快速药敏检测方法能够快速、简便、准确地对该菌进行药敏检测。
迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)是世界范围内水产养殖鱼类一种重要致病菌，可感染包括淡水与海水养殖的多种鱼类，给渔业经济带来了重大损失。目前，在水产养殖过程中，抗生素的使用仍是治疗细菌性疾病的重要手段，但由于抗生素的广泛长期使用，致使水产耐药微生物种类及数量不断攀升。近年来，大量迟钝爱德华氏菌耐药菌株在世界范围内陆续被分离，菌株的抗药性也由单一耐药逐渐发展为多重耐药，且不同分离菌株在耐药特性谱上存在一定差异。在这种情况下，如果盲目使用抗生素，非但达不到理想的治疗效果，反而会使得菌株的耐药性加剧，给水产养殖业甚至人类生命健康安全带来严重威胁。
抗生素敏感试验通过对病原微生物的药物敏感性检测，指导临床科学、准确、及时用药，在避免疾病的流行、药物残留及微生物耐药性加剧等方面起着重要作用。传统药敏试验大多需在专业实验室条件下进行，且需专业人员操作，存在操作繁琐、周期长等问题。另外，目前虽然已有一些快速药敏检测的技术方法,但大多需要专业仪器设备辅助，所以难以在水产养殖生产现场推广使用。为了实现临床现场快速、简便的药敏检测，氧化还原指示剂常被辅助用于药敏检测快速研究，并已在人体病原微生物的快速药敏检测方面取得了丰硕的研究成果，但目前在水产养殖业中却少有应用。
本研究利用阿尔玛蓝作为细菌生长指示剂开展了迟钝爱德华氏菌的快速药敏检测方法的研究，研究结果将为水产病原微生物的快速药敏检测技术的建立与发展提供重要参考。
1材料与方法
1.1试验菌株
迟钝爱德华氏菌JF-1由本实验室从患腹水症的牙鲆体内分离获得，前期感染试验显示菌株JF-1对健康牙鲆的LD50为2.8x105 cfu/mL。
1.2试剂和耗材
培养基(北京陆桥技术有限责任公司，上海生工生物工程公司),抗生素为USP级(上海源叶生物科技有限公司);阿尔玛蓝(美国Invitrogen公司);96孔细胞培养板(丹麦Biosense公司)。
1.3增菌液筛选
为实现迟钝爱德华氏菌快速生长以缩短药敏检测过程，在MHB培养基(美国临床实验室标准化协会CLSI药敏检测基础培养基)配方的基础上，对其进行改良以制成增菌液，改良配方为:MH0(牛肉浸粉6g、可溶性淀粉1.5g、酪蛋白水解物17.5g、NaCl 10 g、CaCl2 2.8 mg、MgCl2 4 mg、蒸馏水1 L)、MH1(牛肉浸粉6g、可溶性淀粉1.5g、酪蛋白水解物17.5g、NaCl10g、CaCl22.8mg、MgCl24 mg、10%鱼汤、蒸馏水1L)和MH2(牛肉浸粉6g、可溶性淀粉1.5g、酪蛋白水解物17.5g、NaCl 10 g、CaCl2.8mg、MgCl2 4mg、鱼肉蛋白胨10g、蒸馏水1L)。分别吸取1mL过夜培养的迟钝爱德华氏菌JF-1转入100mLMH0、MH1和MH2中，混合均匀后分别取5mL混合液加入13支无菌试管中，置于28℃摇床180r/min振荡培养，每隔2h取样一次，于600nm波长下测定OD值，以培养基作为空白对照，绘制菌株JF-1在不同培养基中的生长曲线。
1.4药敏检测接菌密度选定
以MH0培养液将菌株JF-1以10倍梯度稀释为1x103~1x108个/mL，分别接种于无菌96孔板，每孔80μL，每个密度3个重复，加入10μL阿尔玛蓝指示剂，28℃避光培养，每小时取出观察颜色变化，以初步筛选适宜药敏检测的接菌密度。
经初筛选定1x10个/mL和1x106个/mL两个菌液密度，以链霉素为测试药物作进一步试验。用无菌超纯水配制链霉素并稀释至0.256、0.128、0.064、0.032、0.016、0.008、0.004 mg/mL,平行接种于96孔细胞培养板和无菌酶标板内(A1-G6)，每孔10μL，每行为同一质量浓度。在药物阴性对照孔(H1~H6)和空白对照孔内(A7~H7)加入10μL无菌超纯水。将1*10^5个/mL和1*10^6个/mL两个密度菌液分别接种于细胞培养板和无菌酶标板内，每孔80μL，每个质量浓度设3个重复，空白对照孔内接种MH0培养液。在细胞培养板每孔内分别加入10μL阿尔玛蓝指示剂，28℃避光培养，每2h观察并记录颜色变化。当细胞培养板内药物阴性对照孔颜色变粉红后，取出无菌酶标板，以酶标仪于595nm波长下测定OD值，并参照美国临床实验室标准化协会发布的水产细菌药敏检测标准(M49-A)方法计算细菌存活率，将细菌存活率≤20%微孔内的最低药物质量浓度判定为最小抑菌质量浓度。
细菌存活率%=(药物组OD一空白对照组OD)/(药物阴性对照组OD-空白对照组OD)x100%
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