汉森德巴利酵母挥发性化合物抑制乳制品霉菌的机制探究
摘要
本研究评估了从丹麦奶酪盐水中分离的本土汉森德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）菌株对乳制品工业中污染霉菌的拮抗活性。通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）测定染色体多态性，揭示了D. hansenii菌株间巨大的遗传异质性，这在表型水平上反映了种内变异。测试了11株D. hansenii菌株抑制丹麦乳制品中常见污染霉菌——反色枝孢霉（Cladosporium inversicolor）、弯曲枝孢霉（Cladosporium sinuosum）、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）、总状毛霉（Mucor racemosus）和娄地青霉（Penicillium roqueforti）——萌发和生长的能力。特别是所有D. hansenii菌株的无细胞上清液均显著抑制了反色枝孢霉和娄地青霉的萌发。研究进一步探究了D. hansenii无细胞上清液抑制效果背后的因素。基于动态顶空采样结合气相色谱-质谱联用技术（DHS-GC-MS），鉴定出D. hansenii菌株产生的71种挥发性化合物（VOCs），包括6种酸、22种醇、15种醛、3种苯衍生物、8种酯、3种杂环化合物、12种酮和2种酚。
在71种已鉴定的VOCs中，反色枝孢霉的萌发抑制与三种VOCs强烈相关，即3-甲基丁酸、2-戊酮和乙酸。对于娄地青霉，两种VOCs与萌发抑制相关，即丙酮和2-苯乙醇，其中后者还与菌丝体生长抑制强烈相关。3-甲基丁酸的半数最大抑制浓度（IC50）特别低，对反色枝孢霉和娄地青霉分别为6.32–9.53×10⁻⁵和2.00–2.67×10⁻⁴ mol/L。对于2-苯乙醇（一种已知的群体感应分子），IC50对反色枝孢霉和娄地青霉分别为1.99–7.49×10⁻³和1.73–3.45×10⁻³ mol/L。对于乙酸，IC50对反色枝孢霉和娄地青霉分别为1.35–2.47×10⁻³和1.19–2.80×10⁻³ mol/L。最后，2-戊酮和丙酮表现出相对较弱的抑制作用。
本研究表明，从丹麦盐水分离的D. hansenii本土菌株对特定污染霉菌具有拮抗作用，并指出D. hansenii菌株可作为生物保护培养物进行开发，针对奶酪盐水和奶酪表面。
引言
霉菌污染是食品加工中出现的主要问题，不仅导致严重的经济损失和食物浪费，还可能影响食品安全。在乳制品工业中，霉菌污染可出现在整个奶酪生产过程中，因为奶酪会与加工设备和空气接触。霉菌生长尤其在奶酪成熟、储存和分销期间可见，导致奶酪质量下降，包括可见和不可见的缺陷，如霉菌定殖、异味以及霉菌毒素形成的潜在风险。因此，抗真菌化合物和潜在的生物防治剂越来越受到关注，以防止污染霉菌在奶酪上的生长。
酵母被认为与生物防治应用相关，因为其培养要求简单且生物安全性问题有限。多种酵母物种已被证明对霉菌具有拮抗活性，尽管主要应用于控制水果采后病害。在食品生产中，拮抗酵母已在肉类和乳制品等领域被报道，但其应用仍然滞后。多种由生物防治酵母产生的抗真菌挥发性有机化合物（VOCs）与真菌抑制相关，即多种醇（2-苯乙醇、乙醇、2-甲基-1-丁醇和3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇和异戊醇）和酯（乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸异丁酯、2-苯乙基乙酸酯和丙酸乙酯）。尽管多项研究指出VOCs参与生物防治酵母的抗真菌活性，但上述单一VOCs中只有少数被深入研究。此外，拮抗酵母的其他抗真菌作用也被报道，包括酵母与霉菌之间的空间和营养竞争，以及杀手毒素在酵母防御霉菌系统中的作用。
多种酵母已从乳制品和乳制品环境中检测和分离。其中，汉森德巴利酵母获得了欧洲食品安全局（EFSA）的合格安全推定（QPS）地位，使其适合作为乳制品中的生物防治酵母。D. hansenii是一种嗜盐酵母，在大多数奶酪品种相关的酵母物种中占主导地位。此前，我们发现D. hansenii是从Danbo奶酪盐水中分离出的最优势酵母物种，达到≥3.5 log₁₀ CFU/mL。此外，D. hansenii是一种高度异质的物种，在菌株水平上表现出表型差异。菌株间的变异包括同化不同碳源和发酵不同碳源的能力差异、分泌不同的脂肪酶和蛋白酶，以及不同的适宜生长条件。因此，可以预期菌株间拮抗潜力的变异。D. hansenii对污染霉菌的抗真菌活性已在多种食品中被报道，包括干腌肉制品、水果和乳制品。在乳制品中，D. hansenii被报道可减少卡门培尔青霉（Penicillium camemberti）的生长。此外，从蓝纹奶酪中获得的D. hansenii菌株能够在有氧条件下微弱抑制娄地青霉。迄今为止，已发现多种因素影响D. hansenii的抗真菌效率，包括水分活度（aw）、温度、营养可利用性和霉菌浓度。
此外，代谢产物的产生在D. hansenii菌株间存在差异。在先前的研究中，D. hansenii菌株已被证明表现出不同的抗真菌作用，然而，仍需进一步深入研究以探索这些作用。我们此前已确定了从丹麦奶酪盐水分离的D. hansenii菌株的独特生长特性和NaCl耐受性，但迄今为止，其抑制乳制品环境霉菌污染物的潜在能力尚未被探索。
本文旨在评估从丹麦奶酪盐水分离的D. hansenii菌株对不同污染霉菌的抗真菌活性。为此，检测了不同D. hansenii菌株对污染霉菌萌发和生长抑制能力的影响，包括测定单一VOCs的半数最大抑制浓度（IC50）。
材料与方法
酵母和霉菌菌株、培养基及生长条件
本研究使用的所有D. hansenii菌株此前已由Haastrup等人从三家不同的丹麦乳制品厂分离和鉴定：D. hansenii菌株KU-9、KU-10、KU-11和KU-12从乳制品厂A（罐1）分离；KU-27、KU-28、KU-29和KU-30从乳制品厂A（罐2）分离；KU-72从乳制品厂B分离；KU-78和KU-80分别从乳制品厂C（罐1和罐2）分离。反色枝孢霉、弯曲枝孢霉和燕麦镰刀菌从一家丹麦乳制品厂获得，其鉴定经德国微生物保藏中心（DSM）验证。总状毛霉DSM5266（从奶酪分离）和娄地青霉DSM1079（从奶酪分离）从DSM获得。所有霉菌均能在奶酪琼脂上生长，按照Sørensen等人的方法制备，在25°C下培养7天。其中，反色枝孢霉、弯曲枝孢霉、燕麦镰刀菌和娄地青霉通过分生孢子进行无性繁殖，而总状毛霉通过孢子形成进行有性繁殖。以下将用"孢子"指代这五种霉菌的繁殖细胞。
酵母菌株在添加了4%（w/v）NaCl的麦芽酵母葡萄糖蛋白胨肉汤（MYGP添加4%（w/v）NaCl；每升含10g D(+)-葡萄糖一水合物、5g细菌蛋白胨、3g酵母提取物、3g麦芽提取物、40g NaCl，pH调至5.3±0.1）中，于25°C下传代培养；或在添加了4%（w/v）NaCl的MYGP琼脂（在MYGP肉汤添加4%（w/v）NaCl的基础上添加20g细菌琼脂）上传代培养。霉菌常规在麦芽提取物培养基（MEB；每升含20g麦芽提取物、10g D(+)-葡萄糖一水合物、5g细菌蛋白胨，pH调至5.3±0.1）中，于25°C下培养；或在麦芽提取物琼脂（MEA，在MEB肉汤成分基础上添加20g细菌琼脂）上培养。
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