红景天苷对人肺腺癌细胞的上皮-间质转化的影响及作用机制（二）
1.3 细胞培养
肺腺癌PC9细胞在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下用含10%新生牛血清、100 U·mL-1 青霉素、100 μg·mL-1 庆大霉素、低糖-DMEM培养基中培养。用0.25%胰酶消化传代。细胞培养至融合70%~80%后,用无血清培养基饥饿过夜,再加入TGF-β1诱导细胞上皮间质转化处理48 h,按实验要求分为6组:对照组,TGF-β1刺激组,刺激+红景天苷组1 μg·mL-1(sali 1 μg·mL-1 组),刺激+红景天苷组5 μg·mL-1(sali 5 μg·mL-1 组),刺激+红景天苷组10 μg·mL-1(sali 10 μg·mL-1 组),刺激+红景天苷组20 μg·mL-1(sali 20 μg·mL-1 组),肺腺癌PC9细胞在5 ng·mL-1 的TGF-β1刺激30 min后,再给予红景天苷干预,分别在干预后24,48,72 h后进行MTT检测,在各时间段显微镜下观察细胞形态,并摄像记录。
1.4 MTT绘制生长曲线
取对数生长期的细胞,接种于96孔板,每孔细胞密度约1.0×104个,放入CO2培养箱中培养24 h。每孔内加入MTT(5 mg·mL-1)10 μL,培养箱内孵育4 h,弃去每孔的液体,并以每孔150 μL的计量加入二甲亚砜,震荡5~10 min,使甲臜颗粒充分溶解。使用酶标仪检测490 nm及570 nm的吸光度(A)值,以时间为横坐标,A值为纵坐标绘制生长曲线。
1.5 流式检测细胞凋亡
取对数生长期的人肺腺癌PC9细胞,制成单细胞悬液,按每孔1.0×104个,将细胞均匀的接种到6孔板中,37 ℃、5%CO2饱和湿度条件培养过夜;用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞,终止消化后收集细胞,1000 r·min-1,离心5 min,去上清液,PBS重悬润洗2次;1000 r·min-1,离心5 min,去上清液,PBS重悬细胞100 μL,缓慢加入预冷的80%乙醇700 μL,使乙醇终浓度为70% 4 ℃固定4 h以上,1000 r·min-1,离心5 min,预冷PBS润洗2次,加入100 μL RNase(50 μg·mL-1),37 ℃水浴30 min加入PI(50 μg·mL-1)400 μL,4 ℃避光染色30 min流式细胞仪检测。
1.6 Western blotting 分析
冰面上RIPA蛋白裂解液裂解细胞,每5 min振荡1次,裂解 20 min,4 ℃下15 000 r·min-1,离心30 min,吸取上清液获取总蛋白。根据BCA蛋白定量结果上样,10% SDS-PAGE凝胶电泳2.5 h,转膜后NC膜TBS稍荡洗,5% 脱脂奶粉室温封闭1 h,4 ℃下分别孵育E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、a-SMA、β-Catenin一抗过夜,TBST洗10 min×3次,室温孵育二抗1 h,TBST洗10 min,重复3次,曝光显影;采用 BIO-RAD Image Lab 版统计软件进行灰度值分析。
1.7 统计学方法
使用SPSS17.0版统计软件处理数据,计量组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞生长曲线
与Con组比较,TGF-β1组细胞增殖能力显著上升(t=207.277,P<0.05)。与TGF-β1组比较,sali 1 μg·mL-1、sali 5 μg·mL-1组、sali 10 μg·mL-1组和sali 20 μg·mL-1组的细胞增殖力均显著降低(F=1665.398,P<0.05)。见图1。
图1 细胞生长曲线
2.2 细胞凋亡
与Con组[(4.58±0.27)%]比较,与TGF-β1组[(6.21±1.61)%]的凋亡率上升,但差异无统计学意义(t=1.741,P>0.05)。与TGF-β1组比较,sali 1 μg·mL-1组[(7.33±1.11)%]凋亡率差异无统计学意义(t=0.987,P>0.05);sali 5 μg·mL-1组[(13.71±1.66)%],sali 10 μg·mL-1组[(26.15±0.83)%]和sali 20 μg·mL-1组[(28.33±1.11)%]的细胞凋亡率均显著升高(F=180.969,P<0.05),且在一定范围内,凋亡率随着药物剂量的增加而增加。sali 10 μg·mL-1组和sali 20 μg·mL-1组细胞凋亡率均显著高于sali 5 μg·mL-1组和sali 1 μg·mL-1组。见图2。
图2 6组细胞凋亡率
2.3 细胞形态观察
Con组细胞形态多成椭圆形或者圆形,而经过TGF-β1处理后,大部分细胞形态都明显拉长,细胞呈梭形,相邻细胞间连接也变得疏松。sali 1 μg·mL-1组的细胞形态和TGF-β1组形态相似,而sali 5 μg·mL-1组,sali 10 μg·mL-1组和sali 20 μg·mL-1组的细胞形态均多半呈椭圆形,细胞之间连接紧密。见图3。
图3 6组细胞形态
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