阿美替尼对结肠癌SW620、HT29细胞增殖、侵袭迁移和凋亡的作用及机制（二）
1.2 细胞培养
SW620细胞培养于含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养液中，HT29细胞培养于含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的McCoy5A培养液中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的恒温培养箱中。
1.3 CCK-8法检测细胞存活率
消化处理SW620、HT29细胞，牛鲍计数板计数，使细胞悬液浓度为5×10⁴个/mL，充分混悬后接种于96孔板中，每孔加100μL细胞悬液，放于37℃、5% CO₂培养箱中培养。待细胞密度达到60%~80%时，吸除培养液，加入含有不同浓度阿美替尼（0、1、2、4、8、16、32μmol/L）的培养液，每组设置6个复孔，分别孵育24、48h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液（避光），37℃培养箱中孵育40 min，用酶标仪在450nm处测定吸光度（A）值，细胞存活率=（对照组A值－实验组A值）/对照组A值×100%。
1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡
将SW620和HT29细胞接种于6孔板中，每孔2×10⁵个细胞，完全培养液培养，待细胞密度达到60%~80%左右时，吸去孔内培养液，每孔加入含有不同浓度阿美替尼（0、1、2、4μmol/L）的培养液2 mL，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。收集细胞于10mL EP管中，1500r/min离心10min，弃上清，每管加入200μL Annexin V结合液重悬细胞，每管加3μL Annexin V-FITC，冰上孵育15 min，每管加入5μL PI染色液，避光混匀、冰上孵育10 min。每管再加入200μL Annexin V结合液，混匀后用纱布过滤，加入流式管中，样品在1h内用流式细胞仪检测。
1.5 Transwell侵袭及迁移实验
基质胶与无血清培养液按照1:8比例稀释，在Transwell小室上室内加入60μL基质胶，置于37℃恒温培养箱中40min，待基质胶凝固。消化处理SW620和HT29细胞，分别使用无血清DMEM培养液和McCoy5A培养液调整为含有不同浓度阿美替尼（0、1、2、4μmol/L）的2×10⁵/mL细胞悬液。取100μL细胞悬液加入上室，下室加入700μL含10%胎牛血清的培养液，每组设置2个复孔，实验重复3次；培养24h后取出小室，用PBS轻轻冲洗，用4%多聚甲醛室温固定15min，用结晶紫染液室温染色20min。光学倒置显微镜下计数侵袭至微孔膜下层的细胞，每个样本选取3个视野，取平均值。迁移实验无铺基质胶步骤，其余步骤同侵袭实验。
1.6 蛋白印迹（Western blot）实验检测蛋白表达
将SW620和HT29细胞接种于100mm大皿中，当细胞密度达到60%~80%时，加入含有不同浓度阿美替尼（0、1、2、4μmol/L）的培养液处理，给药24h后刮取蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度。根据公式计算加入上样缓冲液和裂解液量，充分混匀，使终浓度相同，蛋白在95℃条件下加热5min。40μg蛋白上样电泳（上层胶电泳70V 30min，下层胶电泳120V 90min），半干转法转至PVDF膜上（恒压24V 30min），快速封闭液封闭20min。根据目标蛋白分子量剪切PVDF膜，孵育相应一抗，4℃孵育过夜。次日用TPBS室温清洗3次，放入对应二抗中，室温孵育1.5h，曝光机显影曝光，采用ImageJ软件分析条带灰度值。
1.7 动物实验
基质胶与PBS按照1:2比例稀释，将SW620细胞离心收集，置于配好的稀释液中充分重悬混匀，将细胞注射到5周龄左右裸鼠右前肢皮下，建立裸鼠模型。待皮下瘤生长至100mm³，随机分为3组（每组6只），分别给予二甲基亚砜、5-氟尿嘧啶20 mg/kg腹腔注射及阿美替尼10mg/kg灌胃，1次/2 d。每次给药前记录裸鼠体重、肿瘤体积大小（肿瘤体积为长×宽²/2）、死亡裸鼠编号，治疗结束后取裸鼠心、肝、脾、肺、肾组织，将获取的标本脱水，石蜡包埋，厚1μm切片，行苏木精-伊红（HE）染色。所有动物研究均经蚌埠医学院实验动物教学与研究委员会批准（[2021]第160号）。
1.8 统计学方法
使用Graphpad Prism 7.0对数据进行统计学分析并作图，计量资料以x±s表示，组间均数比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 阿美替尼抑制SW620、HT29细胞增殖
SW620、HT29细胞给予不同浓度阿美替尼（0、1、2、4、8、16、32μmol/L）培养24h和48h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，结果表明随阿美替尼浓度和培养时间的增加，SW620和HT29细胞存活率逐渐下降。