碳青霉烯类耐药革兰阴性菌联合药敏试验方法学、流程、优缺点和结果判读(二)
5联合药敏试验结果判读
常用部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FIC)为判断依据[18-19],即①FIC≤0.5:协同作用,提示两种药物联合后的抗菌活性显著大于各单药;②FIC>0.5~1:相加作用,提示两种药物联合后的抗菌活性较各单药稍有增加;③FIC>1~2:无关作用,提示两种抗菌药物的活性均不受另一种药物的影响;④FIC>2:拮抗作用,提示一种抗菌药物的活性被另一种抗菌药物削弱。
FIC指数计算公式:
专家共识三:在进行联合药敏试验前,应先进行单药的药敏试验,优先选择敏感的抗菌药物进行联合,或以两药MIC值为中心,上下3~4个浓度进行交叉联合,开展联合药敏试验。
6联合药敏试验方案推荐
由于不同种类的抗菌药物对产生不同碳青霉烯酶菌株的体外抗菌活性不同,不同耐药菌由于耐药机制的差异导致其对抗菌药物的敏感性不同。因此,应根据不同的CRO菌株制定不同的抗感染治疗方案。如头孢他啶-阿维巴坦对于产KPC酶或OXA-48型酶肠杆菌目细菌具有高度抗菌活性,但对于产金属酶菌株需联合氨曲南;替加环素对碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌和鲍曼不动杆菌具有高度抗菌活性,但对铜绿假单胞菌无抗菌活性;而多黏菌素(包括多黏菌素B和黏菌素)对上述三种耐药菌均具有高度抗菌活性(天然耐药菌株除外)。除此之外,磷霉素对肠杆菌目细菌具有较强抗菌活性,但对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌基本无抗菌活性;阿米卡星对CRO菌株具有一定抗菌活性,需根据药敏试验情况而定;而头孢哌酮-舒巴坦(尤其是舒巴坦加大剂量)对于CRAB仍具有一定抗菌活性[22-23]。基于此,实验室在开展针对CRO菌株的联合药敏试验时,需根据不同耐药菌的特征而设计针对性的多药联合药敏试验方案。
专家共识四:各实验室应根据本院CRO菌株耐药机制,制定不同联合药敏试验的抗菌药物组合。
专家共识五:对于新β内酰胺类抗生素-β内酰胺酶抑制剂复方制剂,如头孢他啶-阿维巴坦、美罗培南-韦博巴坦和亚胺培南-瑞来巴坦等,若药敏试验结果显示对该类复方制剂敏感,可直接用于敏感菌所致感染的治疗,无需开展联合药敏试验。
专家共识六:对于不同CRO菌株联合药敏试验抗菌药物的选择,应参考临床抗感染治疗指南或专家共识确定,具体参考表1[22-30]。
表1 CRO联合药敏试验抗菌药物组合推荐
7联合药敏试验方法学简介、优缺点和结果判读(表2)
表2不同联合药敏试验方法学简介、结果报告、抗菌作用、优缺点、结果判读和推荐级别
7.1肉汤微量稀释棋盘法
肉汤微量稀释棋盘法[16-17]用于测定抗菌药物抑制或杀灭微生物的最低浓度,通常以mg/L为单位。抗菌药物A和抗菌药物B经倍比系列稀释后,以不同浓度组合进行混合,经过孵育后阅读单药及两药联合后的MIC。肉汤微量稀释法使用的96孔微量板在最终接种完成后通常每孔中液体终体积为0.1 mL,细菌终浓度为5×105CFU/mL。作为参考方法,肉汤微量稀释棋盘法可精确测定细菌对抗菌药物的敏感性,明确两药之间是否存在协同、相加、无关和拮抗作用(图2和图3)。但该方法比较耗时,工作量大且对方法学技术要求高,因此一般仅用于科学研究,常规实验室通常较少开展。
图2肉汤微量稀释棋盘法协同、相加示意图
图3肉汤微量稀释棋盘法无关、拮抗示意图
7.2琼脂稀释棋盘法
琼脂稀释棋盘法[31]是将两种抗菌药物分别配制成单独的不同浓度的溶液,之后以不同的两药药物浓度组合加入到每一块琼脂平板中,配置成含抗菌药物浓度成倍比系列稀释的药物平板。使用多点接种器将制备好的细菌菌悬液点种到琼脂表面,经35℃16~20 h培养后,肉眼观察细菌生长,以未见细菌生长平板的最低药物浓度为MIC(图4)。其优点是每个平板可同时测定多株细菌,可直接观察受试菌生长是否良好或污染等。但该方法与肉汤微量稀释棋盘法一样比较耗时,工作量大且对方法学技术要求高,因此一般仅用于科学研究,常规实验室通常较少开展。
图4琼脂稀释棋盘法示意图
7.3纸条法
纸条法[17,21,32-34]亦称梯度扩散法,所用材料名称为E试验条(Epsilometer,E-test)和MIC测试条(MIC test strip,MTS),是一种商品化的定量测定细菌对抗菌药物敏感性的方法。它结合了稀释法和扩散法的原理和特点,操作同纸片扩散法一样简便易行,结果又如同稀释法一样,可获得定量的MIC值,结果准确,重复性好。纸条法包括两种:①纸条优加法,操作时在一块已涂布菌液的MHA平板上贴上含抗菌药物A和抗菌药物B的纸条;在另一块已涂布菌液的MHA平板上先贴上含抗菌药物A的纸条,30 min后,待抗菌药物A完全渗透入琼脂中后移去纸条,再在相同的位置覆盖贴上抗菌药物B。过夜孵育后阅读抗菌药物A单药、抗菌药物B单药以及抗菌药物A和抗菌药物B堆叠后的MIC(图5)。②纸条交叉法:抗菌药物A和抗菌药物B纸条垂直交叉放置(单药MIC处交叉,因此需提前测定单药MIC),孵育后阅读联合后抗菌药物A和抗菌药物B的MIC,计算FIC指数,判断两药是否存在协同、相加、无关和拮抗作用(图6)。纸条法具有操作简单的特点,且结果容易阅读。
图6纸条交叉法联合药敏试验
专家共识七:两药协同定义为该菌对抗菌药物A和抗菌药物B单药均为耐药,但抗菌药物B在抗菌药物A存在时表现为敏感或中介。
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