双黄连及各药耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长曲线、毒力因子的影响（二）
2 方法
2.1 药物制备
黄芩、金银花、连翘均购自长春中医药大学第三附属医院，经长春中医药大学方剂教研室鉴定均为正品。双黄连及其拆方依据2020版《中华人民共和国药典》及相关文献进行制备。按处方称取黄芩100 g，加水700 mL煎煮2 h，滤过，再加水适量煎煮2次，每次1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩，于量瓶中定容到100 mL。称取金银花100 g、连翘200 g，加水浸30 min后，煎煮2次，每次加水1500 mL，煎煮1.5 h，合并煎液，滤过，浓缩滤液，量瓶分别定容到100 mL、200 mL。将两次煎煮后的浓缩液合并浓缩至生药1 g·mL⁻¹，离心取上清，滤膜除菌，4℃保存备用。拆方试验中的其他中药提取液按上述同样的步骤进行。
2.2 最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC)
将-20℃冷冻保存甘油菌接种于TSB培养基中过夜培养后，按1：100例接种于CAMHB中培养。采用麦氏单位比浊法测定菌液浓度至OD₆₀₀为0.8，稀释菌液浓度至10⁶ CFU/mL。每孔分别加入100 μL菌液和不同浓度药液于96孔板上。随后置于37℃恒温培养箱培养24 h后，观察有无细菌生长，随后用酶标仪测定OD₆₀₀值。最后将加药培养的菌液均匀铺在TSA琼脂板中，恒温培养(37℃，24 h)观察是否有菌落生成。
2.3 纸片扩散法
将1.5×10⁶ CFU/mL的菌溶液均匀地涂抹于TSA琼脂板上。然后将20 μL药液（1 g·mL⁻¹）加到直径为6 mm的纸片置于琼脂平板上，含20 μL万古霉素（2 mg·mL⁻¹）纸片作为阳性对照，于37℃培养箱中孵育16 h，直尺测量纸片周围抑菌圈直径。
2.4 生长曲线测定
将过夜培养后的USA300以1:100的比例接种于含新鲜TSB培养基的专用微孔板中，并于各孔中加入不同浓度的药液。将微孔板置于丹麦Biosense微生物生长动态监测系统中，于37℃、220 rpm持续振荡条件下培养24小时，系统自动监测并记录600 nm处吸光度（OD₆₀₀）的动态变化，据此绘制生长曲线。
2.5 溶血实验
USA300过夜培养复壮，1：100传代培养至OD₆₀₀为0.3，加入不同浓度的药液于菌液孵育过夜中。当OD₆₀₀为2.5时，离心（5000 r/min，5 min）收集培养上清液100 μL，通过过滤去除杂质。然后将100 μL上清液、850 μL PBS和50 μL无菌新鲜兔血分别加入1.5 mL EP管中（37℃，孵育30 min，5500 g离心）测定OD₅₄₃。以不含上清液的PBS作为阴性对照组，加入10 μL Triton-X 100 作为阳性对照。
2.6 溶血中和实验
USA300过夜培养复壮，1：100传代培养至OD₆₀₀为0.3，将OD₆₀₀为2.5的S. aureus离心，取离心后的100 μL上清液、不同浓度的药液、850 μL PBS和50 μL无菌新鲜兔血分别加入1.5 mL EP管中（37℃，孵育30 min，5500 g离心）测定OD₅₄₃。
2.7 SrtA活性测定
FRET已被应用于鉴定 SrtA转肽酶的活性。每孔加入binding buffer后，加入药液，终体积为每孔100 μL；加入含1%重组SrtA ΔN59蛋白binding buffer于37℃孵育1 h。加入合成底物肽1 μL（1 mg·mL⁻¹，DMSO溶解），37℃避光孵育20 min。使用荧光酶标仪检测荧光强度。通过调整增益值大小，将酶活性调整在900~1100之间，计算药物对 SrtA活性的抑制率。
2.8 生物被膜的形成
向酶标板中分别点入OD₆₀₀为0.3的USA300菌液、ΔsrtA菌液，再加入不同浓度药液。细菌在37℃恒温箱中生长，并孵育24 h以形成生物膜。轻轻洗涤96孔板以消除残留细菌。用0.5%结晶紫对样品染色20 min来评估生物膜的形成。通过PBS缓冲液冲洗轻轻去除未结合的染料，并在室温下吹干。最后加入100 μL无水乙醇，检测OD₅₉₅值。
2.9 蛋白免疫印迹法
将USA300与不同浓度的药液在TSB培养基中混合培养至OD₆₀₀为0.8，随后用PBS洗涤2次后，离心收集菌体。将USA300培养至OD₆₀₀为0.3后，加入不同浓度药液于摇床培养，直至OD₆₀₀达到2.5。收集上清液中的Hla。随后分别采用12% SDS-PAGE凝胶电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。2.5%脱脂牛奶中室温孵育1.5 h后，Hla一抗（1：400稀释)在4℃过夜孵育。TBS-Tween（TBS-T)洗涤后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（H+L）（1：5000稀释）室温孵育2 h。用TBS-T洗涤后，使用特超敏ECL化学发光试剂盒可视化检测，使用ImageJ软件对目标条带进行分析。
2.10 分子对接
使用AutoDock Vina 1.1.3和Autodock tools软件包执行目的蛋白和活性小分子的标准对接程序。基于SrtA的晶体结构（Protein Data Bank [PDB ID: 1T2P]），使用Modeler 9v3构建模型。在Swissdock平台导入蛋白和化合物进行分子对接验证，结合自由能的值为负值时体系更稳定，表明配体与受体结合越紧密。本实验除非另有说明，否则使用默认参数运行。
2.11 统计分析
采用GraphPad Prism 8.0统计软件（GraphPad Software Inc., San Diego, CA, 美国）和SPSS 13.0（SPSS Inc., Chicago, IL, 美国）进行统计学分析。各组数据结果以x ± s表示。正态分布的独立样本比较采用t检验，多组均数间采用One-Way ANOVA方差分析。P<0.05具有统计学意义。
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