3 结果

3.1 双黄连及其各药的体外抑菌效果

为了探究双黄连对USA300的影响，用微孔板法测量MIC，结果显示双黄连的MIC为16 mg/mL。纸片扩散法测试双黄连抑菌能力，用万古霉素作为对照组，显示双黄连的抑菌圈比值为（66.11±14.92）%。见表1。

随后分别对连翘、金银花、黄芩三味药进行了MIC测定，结果可知连翘、金银花、黄芩的MIC分别为16、128、8 mg/mL。连翘对USA300具有较强的抑菌活性，抑菌活性依次为：连翘>双黄连>黄芩>金银花。见图1。

表1 双黄连及各药的MIC和抑菌能力（x ± s）

组别	MIC / mg·mL⁻¹	抑菌圈面积比值 / %
万古霉素	0.002	100.00 ± 11.53
双黄连	16	66.11 ± 14.92
连翘	16	83.24 ± 13.43
金银花	128	/
黄芩	8	53.65 ± 10.20

3.2 双黄连及其各药的时间-生长曲线

根据“3.1”MIC结果，双黄连及各药在MIC浓度时对USA300具有抑菌作用。为进一步验证双黄连及其各药在MIC浓度以下是否具有抑菌作用，进行时间-生长曲线测定。结果表明亚抑菌浓度的双黄连及各药对USA300的生长没有明显抑制作用。见图2。

3.3 双黄连对USA300溶血活性及Hla蛋白的影响

溶血结果显示，与对照组比较，1/32 MIC以上浓度的双黄连对溶血具有抑制作用，并且随着浓度增加，其作用后的兔红细胞上清液颜色逐渐接近澄清。见图3。这表明亚抑菌浓度的双黄连可抑制Hla的溶血活力，且呈现量-效关系。随后为验证双黄连对Hla活性的直接作用，进行溶血中和实验。结果表明，亚抑菌浓度的双黄连能直接中和Hla的活性。蛋白印迹实验结果表明亚抑菌浓度下的双黄连有效地减少了Hla的释放量，呈浓度梯度的方式。见表2。

表2 亚抑菌浓度的双黄连对Hla蛋白的影响（x ± s）

组别	Hla中和实验	Hla蛋白免疫印迹
对照组	100.00 ± 1.37	100.00 ± 3.57
1/2 MIC	60.57 ± 1.14 *	38.88 ± 3.98 *
1/4 MIC	64.98 ± 3.10 *	68.36 ± 10.08 **
1/8 MIC	74.16 ± 2.82 *	82.82 ± 5.13
1/16 MIC	84.03 ± 1.91	83.33 ± 10.07
1/32 MIC	89.57 ± 0.29 **	86.83 ± 1.24
注：与对照组比较，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; n=3。

3.4 双黄连中各药对USA300溶血活性及Hla蛋白的影响

双黄连整方溶血效果显著，我们进一步对其进行拆方探究其各药的作用。溶血结果表明连翘、金银花以及黄芩对溶血作用的最小浓度范围分别为1/32 MIC、1/32 MIC、1/16 MIC，其中以金银花溶血效果最强。见图4。与“3.3”思路一致，针对连翘、金银花和黄芩进行Hla中和实验，观察其是否以中和Hla毒性的形式抑制Hla的活性，结果显示的1/2 MIC～1/32 MIC浓度的连翘、金银花、黄芩均表现出对Hla蛋白的抑制作用。见表3。蛋白免疫印迹实验验证各药是否也主要通过抑制Hla的分泌来降低USA300的溶血活性，据统计结果可观察到连翘、金银花、黄芩能大幅度减少Hla蛋白释放，其作用的最小浓度分别为1/32 MIC、1/32 MIC、1/16 MIC。见表3。

表3 亚抑菌浓度的双黄连中各药对Hla蛋白的影响（x ± s）%

组别	Hla中和实验			Hla蛋白免疫印迹
	连翘	金银花	黄芩	连翘	金银花	黄芩
对照组	100.00 ± 1.71	100.00 ± 16.42	100.00 ± 1.26	100.00 ± 12.46	100.00 ± 8.84	100.00 ± 22.73
1/2 MIC	16.72 ± 0.80 *	3.76 ± 0.33 *	20.80 ± 0.48	20.59 ± 10.10 *	6.14 ± 1.95	55.75 ± 19.11
1/4 MIC	68.83 ± 0.87 *	25.94 ± 0.75 *	57.44 ± 0.81	34.20 ± 14.24 *	7.70 ± 1.36	53.58 ± 15.87
1/8 MIC	80.20 ± 0.98 ***	51.04 ± 2.73 *	57.70 ± 1.48	49.88 ± 19.71 *	14.54 ± 4.60	87.12 ± 11.47
1/16 MIC	89.60 ± 2.46 **	78.67 ± 13.98 *	68.88 ± 1.93 *	67.96 ± 20.38	17.76 ± 6.66 *	89.55 ± 11.62
1/32 MIC	88.86 ± 1.68 ***	79.96 ± 2.67 *	87.68 ± 1.68 **	73.57 ± 19.97	50.80 ± 5.26 **	98.85 ± 0.43
注：与对照组比较，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; n=3。

注：与对照组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.001；n=3。

3.5 双黄连及各药对SrtA的抑制作用

通过FRET可以确定双黄连及各药阻断SrtA催化的转肽作用。结果表明，双黄连能有效抑制SrtA的活性，抑制率高达86.1%，方中金银花、黄芩均对SrtA的活性产生抑制，而连翘对SrtA活性抑制作用弱。见图5。

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