一株高活性且安全的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01：培养基优化与益生特性
MRS肉汤培养基的制备：蛋白胨 10.0 g/L、牛肉膏 10.0 g/L、酵母膏 4.0 g/L、酪蛋白酶消化物 10.0 g/L、柠檬酸三铵 2.0 g/L、乙酸钠 5.0 g/L、硫酸镁 (MgSO4·7H2O) 0.2 g/L、硫酸锰 (MnSO4·4H2O) 0.05 g/L、磷酸氢二钾 2.0 g/L、葡萄糖 20.0 g/L、吐温-80 1.0 g/L，调节pH终值为5.7±0.2后，于121℃下灭菌20 min。
1.2 主要仪器设备
MP502B型电子天平，上海精科仪器公司生产；JA2003型电子分析天平，上海精科仪器公司生产；HY300型超净工作台，苏州华科净化设备有限公司生产；SW-CJ-1FD型超净工作台，苏州华科净化设备有限公司生产；GI36TW型全自动高压灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司生产；LHS-80型恒温恒湿培养箱，上海百典仪器设备有限公司生产；Dragon Med型手动单道可调式移液器，上海大龙医疗设备有限公司生产；GR-207E(G)型冰箱，东芝有限公司生产；ES-1000W型功率调节电炉，南海明辉五金电器厂生产；XW-80A型微型漩涡混合仪，上海沪西分析仪器厂生产；PH400型pH计，安莱立思ALALIS仪器科技（上海）有限公司生产。C模块微生物生长动态监测系统（丹麦Biosense Laboratories A/S），用于实时、自动监测微生物培养液的光密度(OD)与pH值。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株活化方法
将-20℃下保存的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01甘油冻存管取出化冻后，按3%的比例（体积分数，下同）接种于MRS液体培养基，于37℃下恒温静置培养24 h，进行二次活化，活化后的种子液用于后续实验。
1.3.2 活菌计数方法
采用BioSense微生物快速立体计数仪测定鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01的活菌数。 具体步骤为：将待测发酵液样品用无菌生理盐水进行适当梯度稀释后，取一定体积加入仪器专用的一次性计数板中。仪器通过自动聚焦和多视野扫描，结合图像识别算法对荧光染色的活菌进行快速识别与计数，最终直接输出样品的活菌浓度（CFU/mL）。 此方法相比传统的平板计数法，具有快速、自动化程度高、重复性好等优点。
1.3.3 菌株生长规律分析方法
将活化后的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01以3%的接种量接入100 mL MRS基础液态培养基中，置于丹麦Biosense微生物生长动态监测系统的专用培养模块中，于37℃下恒温培养。系统设定为每10分钟自动采集一次数据，连续监测培养液在600 nm波长下的光密度(OD600)及pH值。以时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制菌株的生长曲线，同时绘制pH值随时间的变化曲线。实验结束后，通过系统配套软件导出完整的生长动态与pH变化数据。活菌数的测定用于与OD600值进行关联标定。
1.3.4 营养物质单因素优化方法
碳源的选择：以MRS培养基为基础骨架，分别添加质量分数为0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的葡萄糖，灭菌后分别接种3%（体积分数）的活化后的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01，于37℃下恒温培养22 h，测定其活菌数。
氮源的选择：分别向MRS基础培养基中添加质量分数为0.0%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的酵母粉或添加相同倍数的蛋白胨，灭菌后分别接种3%的活化后的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01，于37℃下恒温培养22 h，测定其活菌数。
生长因子的优化：分别向基础培养基中添加以下物质：①质量分数为0、0.005%、0.010%、0.015%、0.020%、0.025%、0.030%的硫酸锰；②质量分数为0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%的硫酸镁；③质量分数为0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%的D-异抗坏血酸；④与D-异抗坏血酸相同质量分数的维生素B1；⑤与D-异抗坏血酸相同质量分数的维生素C；⑥与D-异抗坏血酸相同质量分数的叶酸。接种3%（体积分数）的活化后的鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01，于37℃下恒温培养22 h，测定其活菌数。
1.3.5 Plackett-Burman实验设计
在单因素实验结果的基础上，采用Plackett-Burman实验设计方法，对1.3.4节所述影响因素进行优化。每个因素取低(-1)和高(+1)两个水平，共12个实验组。每个实验组重复3次，取平均值。
1.3.6 Box-Behnken实验设计
在Plackett-Burman实验结果的基础上，利用响应面分析法进一步对鼠李糖乳杆菌ZB1107-01培养基培养条件进行优化，利用Design-Expert 8.0.5b软件，采用Box-Behnken建立三因素三水平数学模型。
1.3.7 硝基还原酶活性检测
将活化后的培养液按照3%的接种量接入到灭菌后的硝酸盐培养基中，于37℃下培养48 h后，先滴加5%的KI溶液10滴，再滴加5%的淀粉溶液10滴，充分振荡混匀培养基后，观察培养基的颜色变化，同时设置空白对照组。
1.3.8 氨基脱羧酶活性检测
将活化后的LR-ZB1107-01菌株接种于MRS液体培养基中培养过夜，然后按照3%的接种量接入含1%（质量分数）前体氨基酸（鸟氨酸、赖氨酸）的MRS培养基，于37℃下培养72 h。取LR-ZB1107-01发酵液100 μL涂布于BASM培养基，于37℃下培养24 h，观察培养基的颜色变化并记录，以大肠杆菌ATCC25922为阳性对照菌株，同时设置空白对照。
1.4 数据处理
利用Origin 8.0绘制菌株的生长曲线，利用Design-Expert 11软件进行Plackett-Burman和Box-Behnken实验设计与数据分析。
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