益生菌株安全益生特性评价【Box-Behnken实验结果】
2.4 Box-Behnken实验结果及分析
表3 Box-Behnken实验结果
| 试验号 | A/% | B/% | C/% | 活菌数/(108CFU·mL-1) |
| 1 | 0.03 | 0.08 | 3.00 | 2.86±0.17 |
| 2 | 0.02 | 0.10 | 3.00 | 5.10±0.12 |
| 3 | 0.03 | 0.12 | 3.00 | 5.16±0.18 |
| 4 | 0.04 | 0.10 | 3.00 | 2.78±0.08 |
| 5 | 0.04 | 0.08 | 3.50 | 2.89±0.24 |
| 6 | 0.02 | 0.08 | 3.50 | 3.60±0.24 |
| 7 | 0.03 | 0.10 | 3.50 | 3.60±0.21 |
| 8 | 0.04 | 0.10 | 4.00 | 2.88±0.19 |
| 9 | 0.03 | 0.10 | 3.50 | 3.60±0.24 |
| 10 | 0.03 | 0.10 | 3.50 | 3.60±0.25 |
| 11 | 0.03 | 0.12 | 4.00 | 5.17±0.14 |
| 12 | 0.02 | 0.10 | 4.00 | 2.99±0.16 |
| 13 | 0.02 | 0.12 | 3.50 | 5.67±0.07 |
| 14 | 0.03 | 0.10 | 3.50 | 3.60±0.28 |
| 15 | 0.04 | 0.12 | 3.50 | 5.53±0.22 |
| 16 | 0.03 | 0.10 | 3.50 | 3.60±0.29 |
| 17 | 0.03 | 0.08 | 4.00 | 3.60±0.29 |
1)表中，A为D-异抗坏血酸添加量，B为硫酸镁添加量，C为蛋白胨添加量;表4同。
表4 Box-Behnken实验结果分析
| 来源 | 总和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 |
| 模型 | 1688.20 | 9 | 187.58 | 7.81 | 0.0065 |
| A | 187.23 | 1 | 187.23 | 7.79 | 0.0269 |
| B | 996.11 | 1 | 996.11 | 41.46 | 0.0004 |
| C | 16.72 | 1 | 16.72 | 0.69 | 0.4317 |
| AB | 18.35 | 1 | 18.35 | 0.76 | 0.4111 |
| AC | 153.18 | 1 | 153.18 | 6.38 | 0.0395 |
| BC | 24.60 | 1 | 24.60 | 1.02 | 0.3453 |
| A2 | 2.78 | 1 | 2.78 | 0.11 | 0.7439 |
| B2 | 269.74 | 1 | 269.74 | 11.23 | 0.0122 |
| C2 | 29.78 | 1 | 29.78 | 1.24 | 0.3023 |
| 残差 | 168.19 | 7 | 24.03 | ||
| 失拟项 | 168.19 | 3 | 56.06 | 5.74 | 0.062 |
| 净误差 | 0.000 | 4 | 0.00 | ||
| 总误差 | 1856.39 | 16 |
表3列出了Box-Behnken实验结果。由表4分析可知，拟合模型的P=0.0065<0.05，拟合项显著，失拟项F值为5.74，P=0.0622>0.05，失拟项不显著，说明模型与实际情况拟合较好。根据以上分析可知，活菌数Y对自变量D-异抗坏血酸添加量(A)、硫酸镁添加量(B)、蛋白胨添加量(C)的多元回归方程为：
Y = 855.63025 - 4.83768A + 11.15859B - 1.44562C + 2.14213AB + 6.18824AC - 2.47984BC - 0.811830A2 + 8.00391B2 - 2.65968C2
该方程表示了LR-ZB1107-01发酵液中活菌数和3个影响因子之间的显著线性关系。根据回归方程，一次项系数比较大，交互项系数中AC的交互系数较大，说明D-异抗坏血酸和蛋白胨之间的交互效应最大，而BC的交互系数较小，说明硫酸镁和蛋白胨之间的交互效应较小，3种因素两两交互影响结果一致。
为了检验该方程的有效性，对建立的LR-ZB1107-01发酵液中活菌数模型进行方差分析，并对3个因子的偏回归系数进行检测。一次项中B的回归系数高度显著，P值为0.0004，说明硫酸镁添加量对LR-ZB1107-01的生长有着最显著的促进作用。拟合度R2=0.9094，说明该方程对LR-ZB1107-01的实际生长情况拟合较好，具有较好的可信度。
对二阶方程求一阶偏导，当响应值Y(活菌数)达最大时，各因子水平如下：D-异抗坏血酸添加量(A)，0.02%；硫酸镁添加量(B)，0.12%；蛋白胨添加量(C)，3.0%。此时理论预测LR-ZB1107-01的活菌数为8.84×108 CFU/mL，对该配方所获得的培养基进行验证实验，实际活菌数为8.56×108 CFU/mL，比在基础MRS培养基中提高了约10.7倍。Dong等通过响应面法优化了一株唾液乳杆菌的生长培养基，使最大活菌数比在基础MRS培养基中提高了3倍。谢为天等也以MRS培养基为基础，通过优化碳源、氮源以及其他组分，使得一株鼠李糖乳杆菌LT22的最大活菌数提高了6.7倍，达8.17×1012 CFU/mL。因此，LR-ZB1107-01仍有优化空间，可通过后续的发酵罐培养条件（如初始pH值、温度、通气量等）优化来进一步扩大培养。
2.5 安全性及益生特性评价
2.5.1 硝基还原酶实验结果
硝基还原酶可将硝酸盐转化为亚硝酸盐，加入碘化钾溶液后，亚硝酸盐可将碘化钾中的碘元素置换得到碘单质，滴加淀粉后会发生颜色反应。质控菌株（大肠杆菌）的硝基还原酶实验结果为阳性，LR-ZB1107-01的硝基还原酶实验结果为阴性，说明LR-ZB1107-01菌株内并无具活性的硝基还原酶，不会将硝酸盐还原成亚硝酸盐，可以在实际生产中应用。
2.5.2 氨基酸脱羧酶实验结果
少量的生物胺在机体内发挥着重要的生理功能，但生物胺过量也会导致呼吸道等疾病。具有氨基酸脱羧酶活性的菌株可分解氨基酸并生成CO2和生物胺（赖氨酸→赖胺，鸟氨酸→鸟胺），使培养基呈碱性，从而使添加了指示剂溴甲酚紫的培养基呈紫色，因此，若培养基呈紫色则氨基酸脱羧酶实验结果为阳性，若培养基呈黄色则氨基酸脱羧酶实验结果为阴性。LR-ZB1107-01的氨基酸脱羧酶实验结果，可以发现其并无氨基酸脱羧酶活性。
3 结论
文中通过单因素实验、Plackett-Burman实验发现，D-异抗坏血酸、硫酸镁和蛋白胨对鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01的生长影响显著(P<0.05)，影响大小依次为D-异抗坏血酸>硫酸镁>蛋白胨。通过Box-Behnken实验并结合响应面分析，确定鼠李糖乳杆菌LR-ZB1107-01的优化培养基配方如下：在MRS基础培养基上添加0.02% D-异抗坏血酸、0.12%硫酸镁、3%蛋白胨。在此优化条件下，实际最大活菌数达8.56×108 CFU/mL，比在基础MRS培养基中提高了约10.7倍。初步安全性评价结果显示，LR-ZB1107-01菌株的硝基还原酶及氨基酸脱羧酶实验结果均为阴性，表明菌株不会将硝酸盐还原成致癌性的亚硝酸盐，也不会产生大量对人体有害的生物胺，具有一定的安全性，可用于后续的菌粉制备和功能性食品生产。
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