罗伊氏乳杆菌调控免疫应答抑制轮状病毒生长复制的机制研究
罗伊氏乳杆菌可在人体不同部位定植，主要存在于消化系统，也可定植于泌尿系统、生殖系统和皮肤。研究显示：罗伊氏乳杆菌可改善肠道功能和胃肠道症状，恢复人类微生物群的平衡组成，在治疗急性水样腹泻和预防新的腹泻发作方面发挥积极作用。轮状病毒（rotavirus，RV）是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一。研究表明：RV在肠道内的感染和定植可明显减少肠道内乳酸杆菌、双歧杆菌和肠球菌数量。目前，益生菌与口服补液等传统治疗药物相结合，成为RV诱导胃肠炎的治疗干预手段。
本课题组前期通过建立RV感染乳鼠模型并分析RV与细菌之间的关系，对乳鼠肠道内容物进行16S rRNA测序分析，结果显示：与未感染病毒组比较，病毒感染组罗伊氏乳杆菌相对丰度明显降低。罗伊氏乳杆菌对RV复制的影响及其分子机制尚不明确。本研究探讨罗伊氏乳杆菌对RV复制的影响，并阐明小鼠体内免疫因子变化情况，为肠道益生菌在RV临床治疗中的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物、细胞、病毒和菌株
25窝SPF级昆明乳鼠购自锦州医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001，实验动物伦理学审批号：2021014。Caco-2细胞和RV SA11株均由锦州医科大学基础医学院病原生物学实验室保藏。罗伊氏乳杆菌菌株ATCC 23272购自广东微生物菌种保藏中心。
1.2 主要试剂和仪器
胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和DMEM培养基均购自美国Giboco公司，MRS肉汤、MRS琼脂、厌氧袋、厌氧包和厌氧指示剂均购自青岛海博生物技术有限公司，台盼蓝溶液和TRIzol试剂均购自北京Solarbio公司，VP6抗体购自美国ImmuboCruz公司，TB Green® Premix Ex TaqTM（Tli RNaesH Plus）试剂盒和PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒均购自日本TaKaRa公司，1%青-链霉素混合液双抗购自北京索莱宝科技有限公司。恒温CO2培养箱购自美国Nuaire公司，PCR仪购自美国Bio-Rad公司，荧光显微镜购自德国Leica公司，倒置显微镜购自重庆奥特光学仪器有限公司。oCelloScope微生物生长曲线分析系统购自丹麦Biosense公司。
1.3 细胞培养
采用含10% FBS和1%青-链霉素双抗的DMEM培养基培养Caco-2细胞，待细胞贴壁生长，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。于倒置显微镜下观察细胞形态表现和细胞密度，待细胞生长至90%且生长状况良好时即可进行传代培养。
1.4 绘制罗伊氏乳杆菌生长曲线和标准曲线
菌株冻干粉采用0.1~0.2 mL MRS肉汤培养基溶解后，接种于MRS琼脂平板上，37 ℃温箱中厌氧培养48 h后，挑取单个菌落至10 mL MRS肉汤培养基中，37 ℃厌氧培养。采用oCelloScope微生物生长曲线分析系统，在特定厌氧条件下，对菌液进行无标记、实时、动态成像监测。系统自动分析获取与菌液浓度相关的生物量等生长动力学参数。 同时，为建立生物量与活菌数的标准曲线，取不同培养时间点的菌液，进行10倍梯度稀释（10－7~10－1），将各浓度菌液涂布于MRS琼脂平板，至少涂布3个平板，所有平板37 ℃倒置厌氧培养48 h，计数平板菌落数量，并取相同浓度的3个平板菌落数平均值为其活菌数。以时间为横坐标，oCelloScope系统测得的生物量和活菌数为纵坐标绘制罗伊氏乳杆菌生长曲线。选取10－7稀释的菌液进行2倍比稀释涂布平板（2－8~2－1），计算其菌落数，同时测定其菌液对应的oCelloScope生物量数值，随后以菌落数为横坐标，生物量数值为纵坐标，绘制回归分析标准曲线。根据标准曲线和生物量数值计算细菌浓度，筛选罗伊氏乳杆菌培养最佳时间和最适浓度。每毫升中总活菌数（CFU·mL－1）=同一稀释度菌落平均数（CFU·mL－1）×稀释倍数。
1.5 台盼蓝染色法检测Caco-2细胞存活率
Caco-2细胞以每孔2×106个的密度接种于6孔细胞培养板，待细胞密度为80%~90%后，采用5×108、10×108、50×108、100×108、200×108和500×108 CFU·mL－1罗伊氏乳杆菌感染细胞，培养1 h后弃去菌液，PBS缓冲液洗涤5次，每孔加入2 mL含0.5 mg·L－1猪胰酶的DMEM培养液。培养12 h后，PBS缓冲液洗涤3次，胰酶消化，将单细胞悬液与台盼蓝9∶1混合，均匀注入细胞计数板，将计数板放入细胞计数仪中，记录结果，每个样本重复测定3次。细胞存活率=活细胞/总细胞数×100%。
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