水胶体食品微生物计数的智能化解决方案——材料与方法
2. 材料和方法
2.1. 样品采集和制备
从工业制造商处收到卡拉胶粉末样品（n=6），在分析前以室温（20-22°C）储存在无菌密封袋中的标记塑料容器中。选择六个样品（A、B、C、D、E和F）代表按颜色和溶解度区分的不同类型卡拉胶，以涵盖一系列具有挑战性的吸湿性食品样品。卡拉胶粉末样品包括低和高微生物浓度的样品（根据制造商自己的QC和标准），包括一个QC拒收样品（样品A），其微生物污染超过其可接受限度5000 CFU/g。样品A（10% w/w）用于接种污染较少的样品（BS、CS、DS、ES和FS），以在不同类型的卡拉胶中分析不同的微生物负载。此外，通过将拒收样品A与另一批<100 CFU/g的卡拉胶样品A混合，将样品A稀释以获得三种微生物浓度（稀释倍数为5×、10×和50×）。总共分析了14个样品，以下称为原始样品、稀释（/稀释倍数）或接种（S）：（A、A/5、A/10、A/50、B、BS、C、CS、D、DS、E、ES、F、FS）。
2.2. 传统平板计数
将5克卡拉胶粉末与495毫升Butterfield磷酸盐缓冲稀释水（BPDW）一起加入无菌均质袋中。BPDW由499.375毫升蒸馏水和0.625毫升BPDW储备溶液（34克KH2PO4，500毫升蒸馏水，用1M氢氧化钠调节至pH 7.2）组成。将卡拉胶和BPDW的混合物在均质器中以速度设置3均质2分钟。为了计数总需氧平板计数，将2.5毫升稀释样品的等分试样分配到四个空培养皿（90×15毫米）中，总分析体积为10毫升，用约15毫升温热的（46°C）平板计数琼脂（PCA）覆盖，并用无菌L形塑料涂布器快速混合。这对应于最终卡拉胶样品稀释倍数约为600×（495毫升BPDW中的5克，并在琼脂中进一步稀释6×）和PCA平板中最终卡拉胶样品浓度为8.3毫克/毫升。一旦凝固和干燥，平板在35°C下培养72小时。手动计数菌落数量，结果表示为log CFU/g。所有卡拉胶样品（n=14）在两天内进行两次独立分析重复测试。一个琼脂平板定义为一个重复，每个样品产生四个技术重复，每个重复的检测限为40 CFU/g。
2.3. 卡拉胶中蔓延细菌的MALDI-TOF MS鉴定
从传统琼脂平板中选择卡拉胶样品中细菌污染物的蔓延菌落以获得鉴定。通过亚培养在PCA平板（35°C下24-48小时）上获得所选细菌的纯培养物。按照乙醇/甲酸/乙腈方案对PCA平板上的新鲜菌落进行蛋白质提取。所有分离株通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行三次分析，结果由Biotyper算法和数据库在属水平上报告。
2.4. 迷你琼脂平板的制备
使用放置在无菌6孔板中的无菌IntuGrow迷你琼脂平板（直径=25毫米）来计数微菌落。将350微升温热的PCA琼脂（48°C）加入每个迷你琼脂平板中，然后在每个平板上沉积20毫克卡拉胶粉末。为了抑制卡拉胶的水胶体吸湿能力，在顶部添加800微升温热的PCA琼脂，以最小程度地稀释并将卡拉胶粉末封装在两层琼脂之间。这对应于最终卡拉胶稀释倍数57.5×（1.15毫升PCA中的0.02克卡拉胶）和最终迷你琼脂平板中卡拉胶浓度为17.4毫克/毫升。一个迷你琼脂平板定义为一个重复，检测限为50 CFU/g。
2.5. 通过光学延时显微镜检测微生物
将3D光学显微镜扫描系统oCelloScope放置在培养箱（35°C）中，将准备好的迷你琼脂平板的6孔板加载到系统中，使用IntuGrow软件进行延时图像生长分析。微菌落的检测按照先前报道的研究进行，并进行了一些修改。简而言之，每小时为每个孔生成5670张图像，持续20小时。应用的技术设置是照明时间为2毫秒，视野（FOV）为1.4毫米×1.05毫米，聚焦深度为10微米，光学分辨率为1.35微米，光学放大倍数为4.0。成像从下方进行，与由于各种卡拉胶类型的吸湿能力而在琼脂顶部观察到的不规则和变化的琼脂高度相比，迷你琼脂平板内获得了更平坦和光滑的琼脂侧面。相对于水平面倾斜（6.25°）的光学轴能够扫描迷你琼脂平板并形成图像堆栈。通过组合倾斜图像生成单个z平面的投影z堆栈图像。
2.6. 使用算法增强水胶体样品中微菌落的可视化
为了补偿在培养最初几小时内由于卡拉胶粉末的吸湿性质而在琼脂基质中发生的变化，在IntuGrow软件（版本0.1.14.216）中开发了自适应DELAY算法，用于监测微菌落的生长。DELAY功能因此是对样品进行有意的延迟重新调整照明和聚焦。它应用于为经历缓慢几何变化（如膨胀）的样品生成更好聚焦的图像。在这项工作中，延迟时间大致由膨胀琼脂达到其静止形状的时间常数等效设置。延迟图像应用于归一化使用在延迟时间点确定的相同照明和聚焦设置记录的后续延时图像。因此，在正常化图像中延迟时间点之后出现的变化抑制了膨胀琼脂的影响，同时增强了对生长微菌落存在的检测。
图1. 延迟算法中用于图像归一化的成像与扫描步骤流程图，该算法旨在降低琼脂中卡拉胶溶胀效应，并增强最终处理图像中生长微菌落的检测能力。Tdelay表示溶胀过程稳定所需的时间；ReAuto-illumination（自动重照明）与ReAuto-focus（自动重对焦）可在该时间点启动新一轮扫描，并每小时采集一次图像。
2.7. 统计分析
所有微生物计数基于在不同日期进行的两次生物学独立实验，传统平板计数为四次重复（总计n=8），IntuGrow为两次重复（总计n=4）。所有重复的CFU/g结果使用GraphPad Prism 10在叠加散点图中可视化。对于平板上零菌落的样品，使用0.5 CFU的虚拟值来可视化CFU低于传统平板计数和IntuGrow检测限（分别为40和50 CFU/g）的重复次数。对于统计分析，零计数值包括在两种方法每个14个样品的所有CFU计数平均值的计算中。然后对CFU/g的平均值（n=14）进行对数转换，并用于回归分析，其中使用Deming回归比较两种方法在不同卡拉胶类型和微生物浓度之间的计数。插入完美相关线（x=y）作为视觉参考。为了评估和可视化两种方法之间的差异，使用平均值（n=14）计算偏差，制作Bland-Altman图。图表和统计计算使用GraphPad Prism 10进行。
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