lmo1508/lmo1509基因缺失对单增李斯特菌生长曲线、抗氧化应激能力的影响（四）
2.6 氧化条件下Δlmo1508/lmo1509缺失株中荧光值的检测
选择转录水平上升幅度最高且具有显著差异性的Δlmo1508/lmo1509进一步研究，TCS缺失株Δlmo1508/lmo1509的荧光值在BHI、5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+环境下极显著高于参考菌株10403S（图6），说明lmo1508/lmo1509对gsh-px具有负调控作用。
图6 Δlmo1508/lmo1509中pFL516的表达
2.7 lmo1508/lmo1509缺失对LM生长能力的影响
生长能力测定结果显示，缺失株Δlmo1508/lmo1509与亲本株10403S在BHI培养基中的生长趋势相似（图7），表明lmo1508/lmo1509基因不影响菌株10403S的生长能力。
图7 亲本株10403S和缺失株Δlmo1508/lmo1509生长曲线测定
2.8 lmo1508/lmo1509缺失对LM抗氧化应激能力的影响
通过氧化应激试验结果得知，在5 mmol/L Cu2+应激处理后，lmo1508/lmo1509缺失使得LM的存活能力显著降低，10 mmol/L Fe3+的应激处理后，lmo1508/lmo1509缺失使得LM的存活能力极显著降低（图8），说明lmo1508/lmo1509对LM的抗氧化应激能力存在正调控影响。
A. 5 mmol/L Cu2+；B. 10 mmol/L Fe3+。
图8 Δlmo1508/lmo1509在金属离子中的存活率比较
3 讨论
LM入侵宿主的过程中会遇到多种应激条件，氧化应激是其中最常见的一种。为了避免氧化损伤，LM产生强大的酶促抗氧化系统使胞内促氧因子和抗氧因子保持平衡。
GSH-Px是一种重要的抗氧化酶，广泛存在于真核生物和原核生物中。虽已知真核生物中GSH-Px可以利用GSH作为电子供体将过氧化物还原为水和氧，在介导细胞抗氧化应激的过程中作用显著，但是人们对原核生物中的GSH-Px知之甚少。此前，在原核生物中很少有关于gsh-px基因的报道。大肠杆菌中有编码gsh-px的同源基因btuE，对其功能研究表明，这种酶可以防止各种氧化剂的有害影响，让细胞对氧化应激不那么敏感。脑膜炎奈瑟菌中gsh-px的同源基因gpoA的失活增加了该突变体对氧化还原循环剂百草枯诱导的氧化应激的敏感性。这些研究均表明gsh-px参与了氧化应激防御。另有研究发现，在小鼠皮下感染模型中，敲除gpoA的脑膜炎奈瑟菌毒力明显受损，首次为gsh-px参与细菌致病性提供了证据。GSH-Px或许在原核生物的抗逆性和细菌毒力方面起着重要作用，但其具体的转录调控机制目前仍不清楚。目前报告系统是研究转录调控的重要方法，其中GFP是一种经典的报告系统。将目的基因的启动子与GFP相连后，对GFP的荧光强度进行测定即可检测基因的转录表达水平，具有易于检测、灵敏度高、荧光性质稳定、对细胞无毒害、可直接用于活细胞检测等优点，具有极广泛的应用前景。
本研究成功构建gsh-px报告质粒并将其电转入LM野生株10403S感受态中。通过荧光显微镜和酶标仪检测Pgsh-px的表达情况，携带报告质粒的LM菌株10403S-pFL516在显微镜下发出明亮的绿色荧光，且通过酶标仪测得的荧光强度显著高于野生对照株，该质粒在LM中可表达GFP，表明该质粒中携带的gsh-px启动子具有转录活性，为下一步试验奠定了良好基础和技术平台。
LM 10403S基因组编码16组TCS，为了筛选可能参与调控gsh-px的TCS，我们试图分别敲除每组TCS，但最终只成功敲除了14组。将报告质粒分别电转入14对TCS缺失株感受态中，通过测定荧光值，证实其中7个TCS的缺失导致gsh-px基因转录水平上调，说明它们与gsh-px启动子之间存在负调控关系；6个TCS的缺失则导致gsh-px基因转录水平下调，说明它们与gsh-px启动子之间存在正调控关系，lmo2500/lmo2501的缺失使得其荧光值相对于亲本株而言无显著差异。前期的研究中发现GSH-Px对H2O2带来的氧化应激不敏感，对铜和铁金属离子带来的氧化应激敏感。进一步对转录水平上升幅度最高且具有显著差异性的lmo1508/lmo1509这一TCS研究发现，在BHI、5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+条件下，Δlmo1508/lmo1509的荧光值极显著高于亲本株10403S，说明lmo1508/lmo1509对gsh-px具有负调控作用。生长能力测定结果表明lmo1508/lmo1509基因不影响菌株的生长；氧化应激试验结果显示，相对于亲本株，Δlmo1508/1509的抗氧化应激能力显著降低，说明lmo1508/lmo1509对LM的抗氧化应激能力存在正调控影响。
综上所述，本研究利用gfp成功构建了可以反映gsh-px启动子转录活性的pFL516报告质粒，并成功筛选出调控GSH-Px的双元调控系统lmo1508/lmo1509，为进一步探究该TCS在LM中如何调控GSH-Px的功能奠定了基础。
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