葡萄牙棒孢酵母J5的生长特性及其在红谷黄酒酿造中的应用潜力
摘 要：本研究对红谷提取物发酵基质中葡萄牙棒孢酵母J5的生长特性、耐受性和发酵产物特征进行分析。首先利用光学显微镜观察J5的显微形态，测定J5的生长曲线，然后考察J5对乙醇、糖、pH值和温度的耐受性，最后分析J5的发酵产物，并将其挥发性代谢产物与酿酒酵母J2的挥发性代谢产物进行比较。结果表明：J5具有典型的酵母结构，在30 ℃条件下培养20 h进入稳定期。J5对乙醇的耐受能力较弱，发酵培养基糖质量浓度低于15 g/100 mL、pH值在3.5～6.0、温度在20～40 ℃时能够生长。在红谷提取物发酵基质中30 ℃发酵72 h，J5的乙醇产量为（5.34±0.15）g/L，柠檬酸、琥珀酸和乙酸含量随发酵时间的延长而积累。J5发酵液中醇类、醛酮类、吡嗪类、酚类、烃类、含硫类化合物含量显著高于J2发酵液，醛酮类、吡嗪类、烃类、含硫类数量多于J2发酵液。主成分分析结果表明，J5发酵液能够与J2发酵液在共有挥发性代谢产物上区分开，正十九烷、乙酸乙酯、(R)-(—)-2-辛醇、反式-橙花叔醇、月桂酸乙酯、辛酸异戊酯对J5与J2发酵液的区分贡献最大。J5发酵液的特有挥发性代谢产物主要为醛酮类，其中1-辛烯-3-酮的香气活度值最大，为发酵液贡献草药香。本研究结果表明，葡萄牙棒孢酵母具备应用于黄酒酿造的潜力。
在酒类酿造过程中，酿酒酵母承担着将糖类转化为乙醇的核心任务，是公认的酒类酿造核心微生物。然而深入的研究表明，非酿酒酵母在酿造食品的风味形成与品质调控中扮演着不可或缺的角色。非酿酒酵母可借助一系列复杂的生化反应生成大量的呈香、呈味代谢产物，从而优化酒的口感和香气，为酒品增添独特的地域风味，且在增酸、护色、降醇和抑制不良代谢产物的生成等方面有积极作用。利用从野樱桃发酵底泥中筛选的一株葡萄汁有孢汉逊酵母YT-35与商业酿酒酵母共培养发酵野樱桃饮品，发现共培养能够提高发酵月桂酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醇等风味物质的含量，显著丰富了饮品挥发性物质。研究发现，克鲁维毕赤酵母在龙舌兰汁在酿造过程中能够提高异丁醇、乙酸乙酯、乙醛的含量。
葡萄牙棒孢酵母是一种非酿酒酵母，广泛存在于多种发酵食品中。从酒曲中筛选到一株产花香的葡萄牙棒孢酵母CAU417并将其应用于咖啡豆发酵，发酵后的咖啡粉中苯乙醇、3-糠醛香气活度值分别提高了920%、24.3%，赋予咖啡玫瑰花香及复合香气。葡萄牙棒孢酵母作为一种具有强大产酯能力和风味形成潜力的非酿酒酵母，已有研究者将其用于酒类酿造中。将一株葡萄牙棒孢酵母YJ18应用于米香型白酒酿造中，可有效提高米香型白酒的乳酸乙酯和乙酸乙酯含量。但是关于葡萄牙棒孢酵母在红谷黄酒中应用潜力的研究鲜见报道。
本研究以一株来自于红谷黄酒酒曲的葡萄牙棒孢酵母J5为研究对象，考察其生长特性、耐受性和代谢产物特征，评价该菌株在红谷提取物发酵基质中对于红谷黄酒发酵条件的适应性；将葡萄牙棒孢酵母J5与酿酒酵母J2的挥发性代谢产物进行比较，评价葡萄牙棒孢酵母J5的挥发性代谢产物可能对风味带来的影响，以期为葡萄牙棒孢酵母应用于红谷黄酒酿造提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌株、材料与试剂
实验菌株J2和J5分离自南阳红谷黄酒酒曲。采用马铃薯葡萄糖琼脂平板通过涂布法分离（28 ℃恒温培养），并经反复划线纯化后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行ITS rDNA测序鉴定。经NCBI BLAST比对，菌株J2和J5分别被鉴定为酿酒酵母和葡萄牙棒孢酵母。纯化菌株保藏于本实验室—80 ℃超低温冰箱。
葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、琼脂粉、α-淀粉酶、糖化酶、亚铁氰化钾、无水乙醇、硫酸、盐酸、磷酸、硫酸锌（均为分析纯）、甲醇（色谱纯）天津市德恩化学试剂有限公司；乙醇、乳酸、柠檬酸、苹果酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、3-辛醇（均为色谱纯）上海源叶生物科技有限公司；纯净水 娃哈哈集团有限公司。
1.2 仪器与设备
ZXDP-A2270型恒温培养箱 上海智诚分析仪器制造有限公司；TGL-16G高速离心机 上海安亭科学仪器厂；CX21型光学显微镜 日本奥林巴斯公司；PHS-3C型酸度计 上海仪电分析仪器有限公司；1260型液相色谱仪、8890-7250型全二维气相色谱-四极杆串联飞行时间质谱联用仪、ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）、DVB/CWR/PDMS萃取头（固相膜厚度80 μm，膜长度10 mm）美国安捷伦公司；SSM1810型全二维气相色谱固态热调制器雪景电子科技（上海）有限公司；自动进样器瑞士CTC Analytics公司；Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm×7.8 mm）美国Bio-Rad公司。
1.3 方法
1.3.1 培养基的配制
参考方法配制PDA培养基。参考方法配制红谷提取物培养基作为酵母的发酵基质。
1.3.2 种子液的制备
取已活化的酵母菌种斜面，用10 mL的无菌水将斜面菌苔冲洗至90 mL的PDA液体培养基中，制成菌悬液作为种子液备用。采用平板计数法测定菌悬液浓度。
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