银叶树内生菌HU0460活性代谢产物的抑菌与黑胫病菌生长曲线关系
2.2 HU0460代谢产物对黑胫病菌的影响
HU0460玉米固体发酵的代谢产物先经95%乙醇浸提，再经正相硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得不同时间段的流分，检测其抑菌圈大小，结果见图3，其中流分E9~E15均对Pat具有明显的抑菌活性，载样量为100μg时抑菌圈半径达4~5cm，而阴性对照甲醇和二甲基亚砜均无抑菌圈，遂将流分E9~E15合并为活性代谢产物进行后续抗菌机理实验。
进一步将梯度稀释的活性组分加入Pat菌液培养12h后，使用多功能酶标仪检测菌液OD600，采用GraphPad Prism8进行数据分析并绘制抑菌曲线，结果(图4A)显示，随着活性代谢产物浓度的增大，相应的菌液OD600值降低。活性代谢产物对黑胫病菌的半抑菌浓度(IC50)为2.79x10-2μg/mL。依据抑菌曲线的拐点分析，当浓度为2.44x10-3μg/mL时，菌液OD600开始下降，代谢产物处理表现出抑菌的效果，故该拐点对应的代谢产物浓度值即为MIC值;当浓度为3.91x10-2μg/mL时，菌液OD600达到最低值，完全抑制了黑胫病菌的生长，故该拐点对应的代谢产物浓度值为MBC值。
由不同浓度(1/2MIC,MIC,MBC)组的HU0460活性组分处理黑胫病菌后的生长曲线(图4B)可见，不加代谢产物的空白组，生长曲线的迟缓期很短，很快进入生长对数期。而加了代谢产物的实验组，随着代谢产物浓度的增大，菌体生长受抑制越明显。MBC组的生长曲线平坦，前12h的OD600无增长,12h后OD值虽有一定上升,但看不出有生长对数期，表明MBC浓度组的HU0460代谢产物具有显著的杀菌作用(P<0.05)。1/2MIC组和MIC组的生长曲线与空白组相比，菌体生长整体上受到抑制，迟缓期延长，且最大OD600值降低，在培养3~8.5h时OD值没有很明显的对数增长，但经过适应之后于9h后恢复生长活力。综上，活性代谢产物对Pat具有显著的抑菌效果(P<0.05)，且表现出一定的抑菌持续性。
2.3扫描电镜观察HU0460处理后Pat的形态变化
扫描电镜观察HU0460活性代谢产物处理后Pat的形态特征(图5)发现，未做任何处理的空白组，马铃薯黑胫病菌体呈杆状，有鞭毛，菌体饱满、表面平整光滑、边界清晰;MIC处理组的菌体发生了一定程度的形变，部分菌体产生褶皱，表面凹陷;而MBC处理组的菌体畸形明显，大部分菌体出现了破裂和细胞内容物流失等现象。初步推测HU0460活性代谢产物能够穿透甚至破坏Pat细胞膜，导致菌体死亡。
2.4HU0460活性代谢产物处理对Pat菌体的细胞膜电位变化的影响
DiBAC4(3)是一种检测细胞膜电位的亲脂性阴离子荧光染料，其本身无荧光，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出绿色荧光。DiBAC(3)进入细胞，细胞内荧光强度增加(即膜电位增加),表示细胞去极化;反之，细胞内荧光强度降低(即膜电位降低)表示细胞超极化(贾睿等，2021)。将10μLPat菌液和1μL荧光染料混合制片后用荧光显微镜观察，结果如图6A显示，与空白组相比，经MIC、MBC浓度代谢产物处理后的菌体的荧光强度明显增加，其中MBC组的荧光强度与异丙醇阳性对照组接近。在96孔板中将代谢产物和菌液混合培养2h，再加荧光染料孵育10min，采用多功能酶标仪检测荧光强度，可直观地看到1/2MIC组、MIC组和MBC组随代谢产物浓度的升高荧光强度逐步增强(图6B),其中MBC组的荧光强度比阳性对照组还高，与空白组相比差异极其显著(P 0.001),表示Pat的细胞膜明显去极化，可初步推断该代谢产物作用靶点可能在细胞膜上。
2.5 HU0460活性代谢产物对黑胫病菌感染离体马铃薯块茎的抑制效果
薯块接种实验结果(图7)显示，空白组(CK)的薯块颜色正常，未见腐败变化;染病组(Pat)的薯块接种黑胫病菌48h后，明显看到薯块呈现水浸软腐症状，甚至发出强烈腐臭味，表明Pat对薯块有一定的侵染能力。防病组(HU0460+Pat)薯块可见接菌的痕迹，但不出现水浸软腐症状，提示代谢产物对黑胫病菌有很好的抑制效果,有望在马铃薯保鲜贮藏中发挥防护作用。
3讨论
生防菌的筛选热点多在细菌和真菌，马铃薯黑胫病的生防细菌筛选频率最高的是芽胞杆菌属(Bacillus)和假单胞杆菌属(Pseudomona)(孟焕文2020)。本课题组前期从马铃薯根际土中分离到枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amylolique-faciens)和地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)等,制备芽胞杆菌复合菌剂，大田试验已证实其对马铃薯黑胫病有一定防控效果(Mao et al.,2022),但生防细菌施用在大田时常遇到定植不稳定问题，影响了防病的稳定性。
本研究从银叶树的幼嫩枝条分离筛选到1株内生真菌HU0460，以玉米固体培养基大规模发酵并初步分离获得活性代谢产物。通过形态学和分子生物学分析，鉴定内生真菌HU0460为黑孢属真菌(Nigrospora sp.),其代谢产物对Pat有明显的拮抗活性。Gautam等(2022)从药用植物大戟(Euphorbia pekinensis)的叶组织中分离到黑孢属内生菌(Nigrospora sp.),其粗提物具有广谱的抗细菌和抗真菌活性;Wang等(2022)从内生真菌黑孢菌GGY-3发酵产物分离得到托品酮活性代谢产物，能抑制辣椒疫(Phytophthora capsici)和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)的孢子萌发并破坏细胞膜结构。上述报道表明，黑孢菌可产生拮抗病原菌的活性代谢产物，具有生防潜能，这与本研究结果相吻合。
关于内生真菌对病原细菌的作用机理报道主要集中在破坏细胞(壁)膜或影响蛋白质和相关酶的合成等(汪晓辉等,2021)。张倩(2019)从马齿苋(Portulaca oleracea)中筛选出3株具有抑制青枯菌(Ralstonia solanacearum)活性的内生青霉菌(Penicillium),并发现其活性代谢产物通过影响青枯菌的蹭行运动、细胞膜和酶活性从而达到抑菌目的。于艳梅(2015)发现香豆素等植物源化合物可使青枯菌发生形变。国内对马铃薯青枯菌的作用机理研究较多，但对黑胫病菌的作用机理研究尚未见报道。
本研究测定了Nigrospora sp.HU0460的活性代谢产物对Pat的MIC、IC50和MBC的值，表明代谢产物对马铃薯黑胫病菌有抑菌效果，随着活性代谢产物浓度的增加，Pat的生长受抑制越明显，MBC浓度下的代谢产物几乎完全抑制了黑胫病菌的生长;扫描电镜观察发现，随着活性代谢产物浓度的上升，Pat的形态变化程度加剧，其中MBC处理组的菌体明显发生畸形，甚至出现破裂、细胞内容物流失等现象，初步推测HU0460活性代谢产物破坏了Pat细胞膜、从而导致菌体死亡。
DiBAC4(3)是一种荧光膜电位染料，本身无荧光，在与细胞内的蛋白结合后发出荧光。本研究通过荧光强度的变化检测了HU0460代谢产物对Pat膜电位的影响，发现MBC组的荧光强度与空白组相比差异极其显著，表示Pat的细胞膜明显去极化，进一步推断该代谢产物作用靶点可能在细胞膜上。这与宋璐忆等(2021)的报道结果一致，其认为原儿茶醛使福氏志贺菌(Shigella flexneri)的细胞膜发生了超极化，且去极化与超极化程度均与实验组的浓度呈正相关。因黑胫病菌可使马铃薯在种植各阶段和贮藏阶段染病，故本研究进一步采用薯块接菌实验，证实了在离体薯块中代谢产物对黑胫病菌有很强的抑菌效果，这有利于在马铃薯保鲜贮藏中发挥防护作用。所筛选的马铃薯内生真菌及其活性代谢产物，可规避生防菌剂定植不稳定的问题，为马铃薯黑胫病防控提供了微生物源的活性代谢产物，为后续微生物源生物农药研发提供代谢产物资源。
4结论
本研究用组织分离法从银叶树中分离到1株对黑胫病菌有明显抑菌效果的内生真菌HU0460，经鉴定为黑孢属真菌(Nigrospora sp.);经玉米培养基发酵获得其活性代谢产物，该代谢产物对黑胫病菌有较好的抑菌活性，有利于在马铃薯种植阶段和保鲜贮藏环节中发挥防护作用。本研究为马铃薯黑胫病的生物防控提供了生防菌资源，为新型农用抗生素研发提供候选资源和技术储备。
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