基于oCelloScope系统的焦性没食子酸联合唑类抗光滑念珠菌药敏评价
中国临床感染性疾病长期调查研究显示，在非白念珠菌中，光滑念珠菌（Candida glabrata）成为第二大引起侵袭性真菌感染疾病的病原菌。在临床治疗中，光滑念珠菌对唑类药物具有天然抗药的特点，特别是对氟康唑具有迅速产生抗药的趋势。近年来，随着抗真菌药物长期和广泛使用，临床治疗中光滑念珠菌耐药问题日趋严重，了解临床菌株的耐药情况和寻求新的治疗途径具有重要临床意义。
中药治疗真菌感染具有不良反应少、激发形成耐药低和预后良好等优点。众多研究表明，中药对焦性没食子酸（邻苯三酚）是一种多酚类化合物，可在芡实、月季等中药材中提取得到。研究表明不同浓度的焦性没食子酸对白念珠菌、金色葡萄球菌、大肠杆菌等均具有抑菌作用。本实验旨在了解临床分离的光滑念珠菌的药敏情况，便于更好的指导临床用药。运用氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑三种唑类药物联合焦性没食子酸作用于临床分离的光滑念珠菌，观察焦性没食子酸联合唑类药物对光滑念珠菌的抑菌作用，以改善光滑念珠菌临床耐药以及预后情况。
1 材料和方法
1.1 材料
菌株来源 从上海仁济医院、上海东方医院和上海龙华医院共收集光滑念珠菌 116 株，质控菌株为 ATCC 90030，另从上海龙华医院收集临床白念珠菌 49 株，热带念珠菌 42 株，克柔念珠菌 4 株，近平滑念珠菌 13 株。所有菌株均由飞行质谱仪（布鲁克）鉴定到种。
药物 唑类药物氟康唑（fluconazole, FLC）、伊曲康唑（itraconazole, ITR）购于东方生物公司，伏立康唑（voriconazole, VRC）（汇德利康）购于龙华医院，焦性没食子酸（pyrogallic acid）购于上海友丝有限公司。
试剂 DMSO 购于 BIOSHARP 生物公司，MOPS 购于生工生物工程有限公司，RPMI1640 培养基购于埃尔生物公司。
1.2 方法
药物敏感性试验
采用丹麦 BioSense 公司 oCelloScope 快速药敏系统进行药敏试验。将待测菌株接种至含系列浓度唑类药物的 RPMI 1640 培养基微孔板中，每孔终体积 200 μL，接种后立即将微孔板置于 oCelloScope 系统内，于 35 ℃ 连续监测 24 h。系统自动采集各孔实时图像，通过背景校正吸光度（BCA）算法生成生长曲线，并根据预设的终点判读规则自动计算最低抑菌浓度（MIC）值。根据 2017 年 CLSI M60 指南判断光滑念珠菌对氟康唑的敏感性：MIC≤32 μg/mL 为剂量依赖性敏感（susceptible dose-dependent, SDD），MIC≥64 μg/mL 为耐药（resistant, R），采用 ECVs（epidemiological cutoff values）判断伏立康唑和伊曲康唑的敏感性，分别为 MIC<0.25 μg/mL 和 MIC<0.25 μg/mL 为野生型（wild-type, WT），MIC≥4 μg/mL 和 MIC≥4 μg/mL 为非野生型（non wild-Type, non-WT）（Clinical and Laboratory Standards Institute [CLSI], 2018）。
药剂配制
① RPMI 肉汤：称取 34.53 g MOPS, 10.4 g RPMI 内汤，加入 900 mL 无菌蒸馏水，定容至 1 L，过滤器过滤除菌，4℃ 保存备用。
②焦性没食子酸：100 mg 焦性没食子酸粉末加入 1000 μL DMSO 中，摇匀溶解得到浓度为 100 mg/mL，RPMI 肉汤中匀取，倍比稀释得到浓度为 50 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL, 8 μg/mL, 4 μg/mL。
③氟康唑配制：100 mg 氟康唑粉末中加入 20 mL 无菌蒸馏水，取 204 μL 溶解稀释液，定容至 1.25 mL，过滤除菌得到浓度为 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL, 8 μg/mL, 4 μg/mL, 2 μg/mL, 1 μg/mL。
④伊曲康唑配制：100 mg 伊曲康唑粉末中加入 2 mL DMSO 加热至完全溶解，取 62 μL 伊曲康唑储备液加入 50 μL，无菌蒸馏水加热，倍比稀释得到浓度为 32 μg/mL, 16 μg/mL, 8 μg/mL, 4 μg/mL, 2 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.25 μg/mL, 0.125 μg/mL, 0.0625 μg/mL。
⑤伏立康唑配制：130 mg 伏立康唑粉末加入 5 mL 专用溶剂（乙醇：丙二醇各 2.5 mL）混匀中，加入 4.6 mL 无菌蒸馏水和 3.2 mL 的溶解液，混匀，得到浓度为 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL, 8 μg/mL, 4 μg/mL, 2 μg/mL, 1 μg/mL 的光滑念珠菌。焦性没食子酸、伏立康唑和伊曲康唑均用 0.22 μm 滤膜过滤除菌。焦性没食子酸储备液：称取 100 mg 焦性没食子酸粉末加入 1 mL DMSO 中，超声溶解后得到浓度为 100 mg/mL，RPMI 肉汤中匀取，倍比稀释得到浓度为 50 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL, 8 μg/mL, 4 μg/mL, 2 μg/mL, 1 μg/mL。
棋盘格稀释法 采用棋盘格法进行联合药敏试验，并使用 oCelloScope 系统进行实时监测与结果判读。配置 0.5 麦氏度的菌悬液，稀释浓度（1~3）×10⁶ CFU/mL。取 3 个无菌管，编号 1~3，分别加入 900 μL、300 μL 的生理盐水稀释菌液 9 倍的 RPMI 肉汤，取 100 μL 的 0.5 麦氏度的菌悬液到灭菌试管第 1 个离心管中，再到第 2 个离心管混合，吸取 1 mL 加入到第 3 个离心管，得到 1:10 的稀释菌液，接着第 2 个离心管得菌液加入 9 mL 的稀释液，第 3 个离心管得菌液加入 9 mL 稀释液得浓度（1~3）×10⁶ CFU/mL。
棋盘格肉汤稀释法 在 96 孔板的 A~H 行中依次加焦性没食子酸至无菌离心管和 RPMI 肉汤，1~12 列中分别加入标明浓度的唑类药物和焦性没食子酸，H2 为生长素对照。将接种后的微孔板置于 oCelloScope 系统中，于 35 ℃ 连续监测 24 h，系统自动记录各孔生长曲线并计算联合用药的 FICI 值。根据部分菌株高浓度拮抗作用，FICI 值判定标准：FICI≤0.5 为协同作用，0.5<FICI≤1 为无关作用，1<FICI≤4 为相加作用，FICI>4 为拮抗作用。通过 SPSS 21.0 软件计算，运用非参数统计学检验方法，P<0.05 则认为有统计学意义。
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