基于ATMT技术的茄子黄萎病菌高效遗传转化体系及标记菌株特性研究
1.1.2 潮霉素B浓度梯度对茄子黄萎病菌EP-A菌株菌丝生长的抑制效应
取野生型EP-A菌株，经PDA培养基活化后传代培养7 d，制作潮霉素B浓度梯度平板。各处理设3次重复，将平板置于oCelloScope微生物生长监测系统中，25℃连续成像监测14 d，系统自动采集各时间点图像并计算菌落直径，避光培养14 d后导出最终菌落直径数据。
1.1.3 ATMT转化体系构建及关键参数优化
ATMT转化体系构建：将活化后的EP-A菌株接种于CDB液体培养基，48 h后进行分生孢子收集并制备孢子悬浮液。同时，将pKHT2-GFP质粒转化至农杆菌GV3101菌株中，加入50 μg·mL⁻¹卡那霉素、20 μg·mL⁻¹利福平，28℃，200 r·min⁻¹振荡培养48 h。吸取1 mL菌液，加入IM诱导培养基，加入200 μmol·L⁻¹乙酰丁香酚，振荡培养期间采用oCelloScope系统监测菌液生长（BCA值等效OD₆₀₀），直至BCA对应OD₆₀₀值达到0.5。按1:1(V/V)混合取200 μL涂于SM上，25℃，暗培养48 h。筛选培养基中加入50 μg·mL⁻¹潮霉素B和50 μg·mL⁻¹卡那霉素。最终转化效率（一步试验玻片纸转移至培养基，于25℃培养4~10 d到转化子出现，统计最终转化效率，转化率=转化子数/孢子数×100%）。
乙酰丁香酚（AS）浓度梯度优化：IM培养基中AS浓度设置为0、100、200、300、400 μmol·L⁻¹。农杆菌菌液浓度优化：用无菌IM培养基调整至BCA对应OD₆₀₀分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，分生孢子浓度梯度：1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷个·mL⁻¹，共设8个温度；阳性转化子的获得与鉴定
在菌液边缘处挑取少量菌液放入盛有1 mL无菌水的1.5 mL离心管中，制成浓度为5×10⁵个·mL⁻¹的孢子悬浮液。均匀涂布于WA平板上。将菌丝分离获得纯培养后，进行PCR及GFP荧光观察验证，采用方法与PCR体系参照王倩。
1.2.4 转化子特性分析
致病力测定：苗期两对真叶时，转化子及EP-A菌株接种于PDA平板上25℃培养7 d，菌液浓度调至1×10⁶个孢子·mL⁻¹，每个菌株接15株茄子幼苗，28 d后参照茄子黄萎病的病情分级标准调查发病情况。
生长速率测定：将转化子和EP-A菌株活化再转接到PDA培养基中，置于oCelloScope系统中，25℃恒温连续成像监测2~6 d，系统自动计算各时间点菌落直径，取日增长速率。
粗毒素分泌量测定：取转化子边缘菌落接种于PDA新培养基中，25℃恒温培养7 d，冲洗分生孢子并利用血球计数板测量分生孢子数。
粗毒素浓度测定：取转化子和EP-A菌株接种于50 mL液体查（察）氏培养基中，25℃，120 r·min⁻¹振荡培养48 h。菌液过滤过后取15 000×g冷冻沉淀15 min。过滤上清液采用紫外分光光度法（BCA蛋白定量法）测定，获得以牛血清蛋白（BSA）作标准的曲线方程，计算菌株粗毒素的含量。
1.3 数据分析
采用Excel 2010软件进行数据处理，用SAS 9.3软件进行数据统计及分析，采用Duncan新复极差法进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 EP-A菌株对不同潮霉素B的敏感性测定
EP-A菌株对潮霉素B敏感性的测试经过10 d，菌株EP-A在不同浓度潮霉素B的平板上其具体生长状况，潮霉素浓度为0 mg·L⁻¹的平板上EP-A生长良好，当其浓度为25 μg·mL⁻¹时，菌株生长抑制率达到25%左右，差异显著（P<0.05）。当浓度增加至50 μg·mL⁻¹及以上时，菌丝生长受抑制率达100%，不再生长（图1）。经检验，筛选转化子最适宜的潮霉素浓度为200 μg·mL⁻¹。oCelloScope连续监测显示，50 μg·mL⁻¹处理组自培养第3 d起菌落直径即停止增长，与对照差异显著。
2.2 ATMT转化体系构建及关键参数优化
2.2.1 农杆菌介导ATMT转化体系的建立
图1 不同因素（潮霉素浓度、AS浓度、农杆菌菌液浓度、分生孢子液浓度、共培养温度和共培养时间）对转化效率的影响
从试验结果不同梯度处理来看，农杆菌菌液浓度（oCelloScope监测BCA对应OD₆₀₀）影响着转化子及EP-A菌株的转化效率。当农杆菌菌液OD₆₀₀值（BCA等效）由0.2升高至0.6时，EP-A菌株的转化效率由116.33个转化子/10⁶个孢子增加至193.33个转化子/10⁶个孢子。在OD₆₀₀值=0.6时，转化效率最高。之后，随着农杆菌菌液浓度的增加，转化效率呈现降低趋势（图1D）；合适的共培养时间及随转化步骤中的关键环境，试验设置24、25、26、27、28℃共5个温度梯度，发现EP-A菌株的转化效率随着共培养温度的升高呈现先增加后降低的趋势。当培养温度为24~25℃时，EP-A菌株的转化效率达到峰值，转化率为236.67个转化子/10⁶个孢子，随着温度的升高，EP-A菌株的转化效率呈现降低趋势，26、27、28℃条件下的转化效率分别为202.00、174.00、152.00个转化子/10⁶个孢子（图1E）；共培养时间梯度设为12、24、48、72和96 h。EP-A菌株的转化效率随着共培养时间的增加呈现先升高后降低的趋势。其中，在共培养时间为48 h时的转化效率最佳，转化率为200.67个转化子/10⁶个孢子，当其培养时间为12、24 h时，转化效率最低，分别为69.67、77.67个转化子/10⁶个孢子（图1F）。综上所述，EP-A菌株的最优转化体系为：农杆菌液OD₆₀₀=0.6（oCelloScope BCA校准），分生孢子浓度1×10⁶个·mL⁻¹、乙酰丁香酚（AS）浓度200 μmol·L⁻¹、25℃共培养48 h，且与EP-A菌株共培养至分生孢子悬浮液浓度为10⁶个·mL⁻¹，将二者在含有200 μmol·L⁻¹乙酰丁香酚的筛选培养基上共培养48 h。
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