奶酪盐水汉森德巴利酵母对污染霉菌的生物防治活性研究
D. hansenii无细胞上清液以霉菌物种依赖的方式影响污染霉菌的萌发和菌丝体生长
暴露于从稳定期培养物收集的D. hansenii无细胞上清液时，五种霉菌的萌发率和菌丝体生长速率的影响如（表2）所示。对于萌发率，在五种霉菌中观察到对反色枝孢霉的最高显著（P<0.05）抑制，暴露于所有D. hansenii菌株的无细胞上清液时萌发率低于5%。对于娄地青霉，D. hansenii KU-9和KU-11的无细胞上清液对萌发率显示出显著强抑制，分别降至9.5%和6.8%，相比之下其他D. hansenii菌株的无细胞上清液为13.7-33.8%。D. hansenii无细胞上清液对弯曲枝孢霉的萌发率观察到轻微抑制（82.9%）。相反，任何D. hansenii无细胞上清液对燕麦镰刀菌和总状毛霉的萌发率均未观察到显著（P>0.05）抑制效果。
| PFGE聚类 | D. hansenii菌株 | 相对萌发率 (%) | 相对菌丝生长速率 (%) | |||||||||
| C. inversicolor | C. sinuosum | F. avenaceum | M. racemosus | P. roqueforti | C. inversicolor | C. sinuosum | F. avenaceum | M. racemosus | P. roqueforti | |||
| I | KU-78 | 0.4 ± 0.4ᵃ | 74.6 ± 6.6ᵃᵇᶜ | 102.6 ± 2.1ᵃᵇ | 16.2 ± 0.6ᵇᶜ | 56.7 ± 14.0ᵃᵇᶜ | 98.0 ± 6.9ᵃ | 109.5 ± 4.8ᵈ | 90.2 ± 4.6ᵇᶜ | 85.7 ± 3.5ᶜᵈ | 84.9 ± 3.7ᶜᵈ | |
| I | KU-80 | 0.0 ± 0.0 | 91.6 ± 12.6ᵇᶜᵈ | 96.1 ± 3.6ᵃ | 100.8 ± 2.9ᵇᶜ | 27.3 ± 5.4ᶜᵈ | 50.9 ± 8.2ᵃ | 104.2 ± 4.4ᵃᵇᶜ | 96.1 ± 5.9ᵃᵇ | 83.1 ± 11.3ᵃᵇᶜ | - | |
| II | KU-12 | 0.8 ± 0.4ᵃᴮ | 83.6 ± 6.5ᵃᵇᶜ | 99.6 ± 0.5ᵃᵇ | 100.3 ± 1.9ᵇ | 14.9 ± 1.3ᵇ | 79.8 ± 14.5ᵇᶜᵈ | 102.9 ± 3.7ᵃᵇᶜ | 102.9 ± 5.9ᵃᵇᶜᵈ | 91.2 ± 4.5ᶜ | 86.0 ± 4.1ᶜ | |
| II | KU-30 | 0.8 ± 0.4ᵃᵇ | 98.3 ± 18.3ᵇᶜᵈ | 82.0 ± 26.0ᵃᵇᶜ | 98.8 ± 4.4ᵃᵇ | 101.9 ± 1.0ᶜ | 9.5 ± 2.9ᵃᵇ | 59.7 ± 7.7ᵃᵇ | 102.9 ± 3.7ᵃᵇᶜ | 104.1 ± 5.3ᵇᶜᵈ | 82.2 ± 10.3ᵃᵇᶜ | 70.0 ± 6.1ᵃ |
| II | KU-9 | 4.5 ± 0.6ᵈ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| II | KU-72 | 0.4 ± 0.4ᵃ | 86.7 ± 2.2ᵇᶜᵈ | 98.4 ± 2.3ᵇ | 104.5 ± 3.3ᶜ | 13.7 ± 2.9ᶜ | 71.5 ± 9.2ᵇᶜᵈ | 111.7 ± 7.8ᶜ | 100.5 ± 2.5ᵃᵇᶜ | 90.2 ± 3.5ᵇᶜ | 83.0 ± 6.2ᵇᶜᵈ | |
| III | KU-11 | 1.9 ± 0.4ᶜ | 74.6 ± 11.1ᵃᴮ | 99.4 ± 4.0ᵃᵇᶜ | 12.3° 6.8 ± 0.5ᶜ | 64.1 ± 6.0ᵃᵇᶜ | 99.5 ± 5.8ᵃᵇ | 100.6 ± 78.0 ± 3.9ᵇᶜ | 77.0 ± 6.3ᵃᵇ | - | - | |
| III | KU-28 | 1.9 ± 1.1ᵇᶜ | 88.7 ± 1.1ᵇᶜ | 100.6 ± 2.8ᶜ | 101.4 ± 1.8ᵇᶜ | 20.0 ± 2.3ᶜ | 80.6 ± 11.9ᶜᵈ | 100.5 ± 6.3ᵃᵇᶜ | 100.6 ± 1.0ᵃᵇᶜ | 86.8 ± 4.1ᵃᵇᶜ | 85.0 ± 2.3ᵇᶜᵈ | |
| IV | KU-10 | 1.4 ± 0.9ᵃᵇᶜ | 67.3 ± 11.0ᵃ | 102.7 ± 1.1ᵇ | 103.6 ± 3.9ᶜ | 26.1 ± 1.4ᶜ | 63.4 ± 6.3ᵇᶜ | 4.4867.3 ± 11.0ᵃ | 86.8 ± 4.1ᵃᵇᶜ | 85.0 ± 2.3ᵇᶜᵈ | - | |
| IV | KU-29 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| IV | KU-27 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
对于菌丝体生长速率（对应于霉菌的指数生长期），所有D. hansenii菌株的无细胞上清液诱导了对反色枝孢霉的抑制（69.3%），同时对娄地青霉（83.0%）和总状毛霉（86.8%）观察到轻微抑制。弯曲枝孢霉和燕麦镰刀菌的菌丝体生长速率不受任何D. hansenii无细胞上清液的影响。D. hansenii菌株稳定期培养物收集的无细胞上清液的有限效果通过霉菌的生长曲线进一步证实（图2）。因此，对于反色枝孢霉和娄地青霉，达到稳定期的时间点被D. hansenii无细胞上清液延迟，而对弯曲枝孢霉、燕麦镰刀菌和总状毛霉未观察到抑制效果。此外，在培养结束时（即48小时），D. hansenii无细胞上清液未导致任何五种测试霉菌的菌丝体生长减少。总体而言，这些结果表明D. hansenii无细胞上清液主要以霉菌物种依赖的方式影响萌发阶段，而非D. hansenii菌株依赖的方式。
图2 | 来自汉逊德巴利酵母菌株 KU -9、 KU -10、 KU -11、 KU -12、 KU -27、 KU -28、 KU -29、 KU -30、 KU -72、 KU -78和 KU -80的无细胞上清液对五种霉菌生长的影响（以oCelloScopeTM测得的标准化 SESA 值表示）：(A)皱褶枝孢霉；(B)燕麦镰刀菌；(C)聚孢毛霉；(D)反色枝孢霉；(E)罗克福尔青霉。每个数据点代表三次独立实验的平均值，误差线表示标准偏差。(F) oCelloScopeTM拍摄的反色枝孢霉（蓝色）和罗克福尔青霉（红色）在酵母蛋白胨培养基（对照组）或添加汉逊德巴利酵母菌株 KU -27无细胞上清液24小时后的生长图像示例。比例尺：300 µm
汉森德巴利酵母以菌株依赖的方式产生抗真菌VOCs
为阐明拮抗活性涉及的作用机制，测定了11株D. hansenii菌株稳定期培养物产生的VOCs。通过GC-MS共检测到71种代谢物并鉴定，即6种酸、22种醇、15种醛、3种苯衍生物、8种酯、3种杂环化合物、12种酮和2种酚。每种代谢物组的相对含量如（表3）所示。在D. hansenii菌株间观察到VOC含量的变异。特别是酸、醇、苯衍生物、酯、酮和酚是产生的VOCs之一。除KU-80外，所有D. hansenii菌株均检测到醛含量显著降低，而所有D. hansenii菌株的杂环化合物含量均降低。此外，D. hansenii菌株（KU-12和KU-30）产生了显著含量的酸和酮。而一些D. hansenii菌株产生了显著含量的苯衍生物（KU-9、KU-11和KU-27）、酯（KU-78、KU-9、KU-10、KU-29和KU-27）和酚（KU-11）。因此，从D. hansenii菌株获得了菌株依赖的VOCs图谱，然而，VOCs图谱与PFGE的遗传聚类之间未观察到相关性。
图3 | 靶向单一挥发性有机物在不同浓度（100、10⁻¹、10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵及10⁻⁶ mol/L）下对C. inversicolor(A)和P. roqueforti(C)的发芽率（%）以及C. inversicolor(B)和P. roqueforti(D)的菌丝生长速率（µ /h）的抑制作用。每个数据点代表三次独立实验的平均值，误差线表示标准偏差。
为更好地理解D. hansenii菌株产生的VOCs与其抗真菌行为之间的相关性，应用了Spearman等级相关分析。相关性和系数分析的结果如（表4）和补充图3所示。在71种VOCs中，乙酸、3-甲基丁酸和2-戊酮与反色枝孢霉的萌发率表现出强负相关。对于娄地青霉，2-苯乙醇与萌发率和菌丝体生长速率均表现出强负相关，而丙酮与萌发率表现出强负相关。因此，这五种VOCs被选为后续实验的目标单一VOCs。
| PFGE聚类 | 样品 | 酸类 (n=6) | 醇类 (n=22) | 醛类 (n=15) | 苯衍生物 (n=3) | 酯类 (n=8) | 杂环化合物 (n=3) | 酮类 (n=12) | 酚类 (n=2) |
| 对照 | 0.06ᵃ | 81.47ᵃ | 14.56ᶜ | 0.01ᵃ | 1.90ᵃᵇ | 0.15ᵉ | 1.82ᵃᵇ | 0.01ᵃ | |
| I | KU-78 | 0.09ᵃᵇ | 87.29ᵇ | 6.65ᵇ | 0.05ᵃᵇᶜ | 4.80ᶜᵈ | 0.08ᶜᵈ | 1.02ᵃ | 0.02ᵃᵇ |
| I | KU-80 | 0.06ᵃ | 81.28ᵃ | 14.38ᶜ | 0.05ᵃᵇᶜ | 2.67ᵃᵇ | 0.05ᵃ | 1.29ᵃ | 0.01ᵃ |
| II | KU-12 | 0.14ᵇ | 89.68ᵇᶜ | 3.22ᵃᵇ | 0.04ᵃᵇᶜ | 3.32ᵃᵇᶜ | 0.08ᶜᵈ | 3.50ᶜ | 0.01ᵃ |
| II | KU-30 | 0.13ᵇ | 90.20ᵇᶜ | 2.62ᵃᵇ | 0.05ᵃᵇᶜ | 3.48ᵇᶜ | 0.08ᶜᵈ | 3.43ᶜ | 0.02ᵃᵇ |
| II | KU-9 | 0.05ᵃ | 90.50ᵇᶜ | 2.47ᵃᵇ | 0.06ᵇᶜ | 5.36ᵈ | 0.09ᶜᵈ | 1.45ᵃ | 0.02ᵃᵇ |
| II | KU-72 | 0.08ᵃᵇ | 92.34ᶜ | 3.09ᵃᵇ | 0.03ᵃᵇᶜ | 1.69ᵃ | 0.08ᶜᵈ | 2.66ᵇᶜ | 0.02ᵃᵇ |
| III | KU-11 | 0.11ᵃᵇ | 91.94ᶜ | 4.53ᵃᵇ | 0.06ᵇᶜ | 1.89ᵃᵇ | 0.10ᵈ | 1.32ᵃ | 0.04ᵇ |
| III | KU-28 | 0.05ᵃ | 93.19ᶜ | 2.45ᵃᵇ | 0.05ᵃᵇᶜ | 3.21ᵃᵇᶜ | 0.06ᵃᵇᶜ | 1.00ᵃ | 0.01ᵃ |
| IV | KU-10 | 0.09ᵃᵇ | 90.73ᵇᶜ | 3.49ᵃᵇ | 0.04ᵃᵇᶜ | 4.54ᶜᵈ | 0.08ᶜᵈ | 1.0ᵃ | 0.01ᵃ |
| IV | KU-29 | 0.05ᵃ | 92.15ᶜ | 1.58ᵃ | 0.03ᵃᵇᶜ | 5.30ᵈ | 0.07ᵇᶜ | 0.78ᵃ | 0.03ᵃᵇ |
| IV | KU-27 | 0.08ᵃᵇ | 88.97ᵇᶜ | 3.77ᵃᵇ | 0.07ᶜ | 5.67ᵈ | 0.05ᵃᵇ | 1.40ᵃ | 0.01ᵃ |
表4 | D. hansenii菌株无细胞上清液中检测到的VOCs与萌发率(%)/菌丝生长速率(μ/h)之间的斯皮尔曼相关系数分析
| 霉菌生长阶段 | 霉菌种类 | 挥发性化合物 | R值（斯皮尔曼）ᵃᵇ | 关联强度 |
| 萌发率 | C. inversicolor | 乙酸 | -0.795 | 强 |
| C. inversicolor | 3-甲基丁酸 | -0.851 | 强 | |
| C. inversicolor | 2-戊酮 | -0.731 | 强 | |
| P. roqueforti | 丙酮 | -0.860 | 强 | |
| P. roqueforti | 2-苯乙醇 | -0.753 | 强 | |
| 菌丝生长速率 | P. roqueforti | 2-苯乙醇 | -0.881 | 强 |
目标单一VOCs抑制污染霉菌的萌发、菌丝体生长和菌丝体膜形成
依次检测了目标单一VOCs对反色枝孢霉和娄地青霉不同生长阶段（即48小时内的萌发率和菌丝体生长速率）的抑制效果。基于（图3）中的萌发率和菌丝体生长速率，分别计算了每个生长阶段的半数最大抑制浓度（IC50）（表5）。
对于萌发率，需要逐渐增加3-甲基丁酸、2-苯乙醇、乙酸、2-戊酮和丙酮的浓度，以获得反色枝孢霉和娄地青霉的IC50。对于3-甲基丁酸，反色枝孢霉和娄地青霉的IC50分别为9.53×10⁻⁵和2.00×10⁻⁴ mol/L。对于2-苯乙醇，反色枝孢霉和娄地青霉的IC50分别为1.99×10⁻³和1.73×10⁻³ mol/L。对于乙酸，反色枝孢霉和娄地青霉的IC50分别为2.47×10⁻³和2.80×10⁻³ mol/L。2-戊酮对反色枝孢霉和娄地青霉的萌发率具有抑制效果，IC50分别为1.06×10⁻²和2.60×10⁻² mol/L。最后，丙酮在实验期间（48小时）对反色枝孢霉的萌发率几乎没有抑制效果，但以IC50为9.2×10⁻² mol/L微弱抑制了娄地青霉的萌发率。
图4. 基于延时显微镜图像的微生物计数方法可在芽孢杆菌属（Bacillus spp.）开始群集覆盖其他菌落之前对微生物菌落进行计数。黄色圆圈标示的菌落因发生群集现象而无法通过传统终点计数法进行计数。完整的延时记录视频可参见补充文件S3。
对于菌丝体生长速率，需要逐渐增加3-甲基丁酸、乙酸、2-苯乙醇、2-戊酮和丙酮的浓度，以获得反色枝孢霉和娄地青霉的IC50。对于3-甲基丁酸，反色枝孢霉和娄地青霉的IC50分别为6.32×10⁻⁵和2.67×10⁻⁴ mol/L。对于乙酸，反色枝孢霉和娄地青霉的IC50分别为1.35×10⁻³和1.19×10⁻³ mol/L。对于2-苯乙醇，反色枝孢霉和娄地青霉的IC50分别为7.49×10⁻³和3.45×10⁻³ mol/L。此外，2-戊酮对反色枝孢霉和娄地青霉的菌丝体生长速率表现出微弱抑制效果，而丙酮对两种测试霉菌的菌丝体生长速率未表现出抑制效果。
最后，为确认IC50结果并评估暴露于不同浓度目标VOCs的长期影响，在7天培养后通过目视检查评分菌丝体膜形成的完全抑制情况（表6）。如预期，长期暴露于目标VOCs后，菌丝体膜形成的抑制确认了反色枝孢霉和娄地青霉的IC50结果。因此，对于反色枝孢霉和娄地青霉，3-甲基丁酸获得了最高的抑制效果，其浓度分别为10⁻³和10⁻² mol/L。防止菌丝体膜形成的2-苯乙醇和乙酸浓度对反色枝孢霉和娄地青霉分别为10⁻²和10⁻¹ mol/L。此外，2-戊酮对反色枝孢霉的浓度为1 mol/L，而7天后对娄地青霉的菌丝体膜形成未观察到抑制。最后，丙酮在7天后对两种霉菌的菌丝体膜形成均未抑制。
在目标VOCs中，计算了在实验条件下生长时D. hansenii菌株产生的估计浓度。发现D. hansenii菌株产生的2-苯乙醇估计浓度为10⁻³ mol/L，这与检测到的反色枝孢霉和娄地青霉的IC50处于同一浓度水平。菌株还产生了3-甲基丁酸和2-戊酮的估计浓度为10⁻⁶ mol/L，以及乙酸和丙酮的估计浓度为10⁻⁴ mol/L，这些均低于相应VOCs对反色枝孢霉和娄地青霉的检测IC50。
| 霉菌生长阶段 | 挥发性化合物 | C. inversicolor | P. roqueforti |
| IC₅₀ (mol/L) | |||
| 萌发率 | 乙酸 | 2.47 x 10⁻³ | 2.80 x 10⁻³ |
| 3-甲基丁酸 | 9.53 x 10⁻⁵ | 2.00 x 10⁻⁴ | |
| 丙酮 | > 1 | 9.21 x 10⁻² | |
| 2-戊酮 | 1.06 x 10⁻² | 2.60 x 10⁻² | |
| 2-苯乙醇 | 1.99 x 10⁻³ | 1.73 x 10⁻³ | |
| 菌丝生长速率 | 乙酸 | 1.35 x 10⁻³ | 1.19 x 10⁻³ |
| 3-甲基丁酸 | 6.32 x 10⁻⁵ | 2.67 x 10⁻⁴ | |
| 丙酮 | > 1 | > 1 | |
| 2-戊酮 | 9.45 x 10⁻¹ | 9.51 x 10⁻¹ | |
| 2-苯乙醇 | 7.49 x 10⁻³ | 3.45 x 10⁻³ | |
表6 | 五种VOCs在7天后对霉菌菌丝膜形成的影响
| 霉菌种类 | 浓度 (mol/L) | VOCs | ||||
| 乙酸 | 3-甲基丁酸 | 丙酮 | 2-戊酮 | 2-苯乙醇 | ||
| C. inversicolor | 10⁰ | +++ | +++ | - | +++ | +++ |
| 10⁻¹ | +++ | +++ | - | - | +++ | |
| 10⁻² | ++ | +++ | - | - | + | |
| 10⁻³ | - | ++ | - | - | - | |
| 10⁻⁴ | - | - | - | - | - | |
| 10⁻⁵ | - | - | - | - | - | |
| 10⁻⁶ | - | - | - | - | - | |
| P. roqueforti | 10⁰ | +++ | +++ | - | - | +++ |
| 10⁻¹ | +++ | +++ | - | - | +++ | |
| 10⁻² | - | +++ | - | - | + | |
| 10⁻³ | - | - | - | - | - | |
| 10⁻⁴ | - | - | - | - | - | |
| 10⁻⁵ | - | - | - | - | - | |
| 10⁻⁶ | - | - | - | - | - | |
+++ 未形成菌丝体膜；++ 6个重复中≤3个形成菌丝体膜；+ 6个重复中≤5个形成菌丝体膜；- 无抑制。
相关新闻推荐
1、Mg²⁺对嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长、氧化活性的影响规律——摘要、材料和方法
2、Y群脑膜炎奈瑟菌对13种抗菌药物敏感性试验——摘要、材料与方法
3、不同光照、pH条件对血红密孔菌培养过程中生物量、总抗氧化能力的影响（一）