基于血凝滴度检测绘制H1N1 型流感病毒（IVR-238）生长曲线（二）
1.5 病毒接种培养
采用鸡胚尿囊腔接种法，将毒种用PBS稀释后，使用1ml的一次性注射器接种鸡胚尿囊腔。每枚鸡胚接种0.2ml并标记培养时间，分别为24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h、72 h，每个培养时段10枚鸡胚。接种后气室朝上置于温度33～35℃，湿度45%～65%的环境内培养。试验重复三次。
1.6 冷胚收获尿囊液
培养至相应的培养时段后将标记对应培养时长的鸡胚取出，放置于2～8℃环境下进行冷胚12-16小时。每个培养时长随机选出5枚冷胚12小时后的鸡胚，收获尿囊液，进行血凝滴度检测。
1.7 血凝滴度检测和结果判定
血凝板第1孔加入生理氯化钠溶液80 μl，第2孔至第12孔各加入生理氯化钠溶液50 μl。取供试品20 μl加入血凝板第1孔，反复吹吸混匀，从中吸取50 μl加入第2孔，以此类推，等体积倍比稀释直至第12孔，最后一孔吸取50 μl弃去。另设2孔，每孔加入50 μl生理氯化钠溶液作为阴性对照。在已加样的微孔中各加入1%鸡血红细胞悬液50 μl，轻轻振荡混匀，置室温作用30分钟后，将血凝板倾斜60°并放置30秒，观察并记录红细胞凝集结果。以血凝出现“++”病毒最高稀释度为该病毒的血凝滴度。阴性对照孔应呈现完全不凝集（即为“—”），否则此次检验无效。
2 结果
（1）对各个培养时间段（24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h、72 h）的血凝滴度检测结果进行汇总后求平均值。在培养温度、湿度相同的条件下，在培养24 h时血凝滴度的平均值不高于1：160，在培养32 h后，流感病毒尿囊收获液血凝滴度的平均值均不低于1：160，在培养56 h～64 h时，流感病毒尿囊收获液血凝滴度的平均值稳定，且第三次实验流感病毒尿囊收获液血凝滴度的平均值在64 h时达到最大，最大平均值为1：1024。
（2）根据血凝滴度检测结果，三次试验H1N1型流感病毒的生长曲线显示，在培养温度、湿度相同的条件下，血凝滴度检测结果趋势一致：第一次实验在24～32 h呈上升趋势，在32～64 h趋势平稳，在64～72 h均呈下降趋势；第二次实验在24～56 h呈上升趋势，在56～64 h趋势平稳，在64～72 h均呈下降趋势；第三次实验在24～64 h呈上升趋势，在64～72 h均呈下降趋势。由三次实验可以得出，H1N1型流感病毒（IVR-238）生长曲线均在56～64 h趋于稳定，处于平稳期。
（3）将三次试验平均后的数据进行汇总求总平均值，得出H1N1型流感病毒生长曲线。由试验数据得出，H1N1型流感病毒（IVR-238）生长曲线在24～56 h呈上升趋势，在56～64 h趋于稳定，处于平稳期，在64～72 h呈下降趋势。H1N1型流感病毒（IVR-238）最佳病毒培养时间为56～64 h。
3 讨论
甲型流感病毒是引起流感大流行的最主要病原体，通过每隔几十年出现一次的季节性流行和大流行，造成重大的人类发病率和死亡率。这些病毒在很大程度上仍然是公众健康的威胁，主要是因为它们具有很高的遗传变异性。由于流感病毒基因多变性和宿主多样性，以及新型变异毒株的不断出现，研究最新的流感病毒毒株，接种流感病毒裂解疫苗（流感疫苗）对预防流行性感冒就至关重要。
本次研究对象为2023年WHO公布的H1N1型毒株A/Victoria/4897/2022（AH1N1pdm09）的重配株（IVR-238）。经过实验数据的处理分析，可以得出，H1N1型（毒株IVR-238）流感病毒培养56 h～64 h生长曲线处到平稳期，H1N1型流感病毒（IVR-238）最佳培养时间为56～64 h。H1N1型（毒株IVR-238）流感病毒培养32 h后，流感病毒尿囊收获液血凝滴度均不低于1：160。由于每个型别病毒感染能力、增殖能力存在差别，以及不同型别间增殖的差别，此次试验数据只针对2023年WHO公布的H1N1型毒株A/Victoria/4897/2022（AH1N1pdm09）的重配株（IVR-238）。
我们无法预测流行性感冒的发展趋势，是否会出现新的亚型、是否会跨物种传播、是否会造成新的大流行，所以需对流感病毒进行深入研究，积极研发更有效的疫苗和抗病毒药物，积极开发更有效的检测手段，尽量避免大流行的出现，确保公众健康。H1N1型流感病毒生长曲线的测定，有助于进一步研究病毒在细胞内的生长规律，为疫苗培育、抗病毒药物筛选等研究奠定基础。做生长曲线实验时考虑到，工业化生产与实验室实验存在差别，工业化生产不能按照每个型别最优培养时间及温湿度进行控制，生产型别时培养时间在对数期后期和平稳期都可接受。
此次对H1N1型流感病毒（IVR-238）的生长曲线进行研究，为四价流感疫苗生产工艺提供数据支撑，为易变异的病毒类疫苗的工艺开发提供技术借鉴。
包含“生长曲线”的参考标题：
1. H1N1型流感病毒（IVR-238）生长曲线测定与分析
2. 基于鸡胚培养的流感病毒生长曲线研究
3. 流感病毒IVR-238生长曲线优化与疫苗生产应用
4. 生长曲线在病毒培养时间确定中的关键作用
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