多功能根际促生菌A11的分离、全基因组测序及其在大豆种子萌发中的应用
2 结果与分析
2.1 菌株分离、鉴定及生理生化特征
2.1.1 菌株A11形态学及生理生化特征
采用稀释涂布平皿法从新疆干旱生境下大豆根际分离纯化出一株编号为A11的菌株，目前保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏编号：CCTCC M20242725)。菌株A11在LB固体培养基中的菌落形态呈圆形，凸起淡黄色，表面光滑湿润，边缘较整齐(图1A)。革兰氏染色为阴性，菌体形态为杆状，菌体长度为2.0-2.5 µm，宽度为1.0-1.5 µm (图1B)。采用丹麦Biosense微生物生长动态监测系统oCelloScope实时监测菌株A11的生长曲线，结果如图2A所示：36-72 h细胞的生长速度最快，72-120 h处于稳定期。溶血试验结果为阴性(图2B)，表明该菌株无溶血特征。接触酶结果为阳性。耐盐碱实验表明，该菌株能够在pH 4.0-9.0的范围内生长，最适pH值为7.0 (图3A)。菌株A11可耐受1.5% NaCl浓度，在1% NaCl浓度下生长最好(图3B)。
2.1.2 分子鉴定及系统发育树构建结果
凝胶电泳图表明菌株A11的16S rRNA基因片段大小为1 500 bp左右(图4)。进一步将菌株的16S rRNA基因序列上传至EzBioCloud进行同源性比对分析，发现菌株A11与A. pittii CIP 70.29T相似度最高，为99.65%。运用MEGA 11.0构建系统发育树，结果表明菌株A11隶属于不动杆菌属(图5)，与A. pittii CIP 70.29T亲缘关系最近，处于同一分支。
2.2 菌株A11基因组序列特征分析
2.2.1 基因组组装与预测分析
Illumina NovaSeq X Plus二代测序平台测序结果和编码基因分析结果如表1所示。将菌株A11组装好的基因组数据上传至NCBI获取登录号JBPPST000000000。菌株A11通过质控的reads共10 420 438条，基因组全长4 512 900 bp，G+C含量为39.44%。单条序列最大长度为134 292 bp，拼接序列总数3 205，预测到的编码蛋白序列数目为5 870，其中包括5 790个编码序列(coding sequence, CDS)、74个tRNA、4个rRNA以及2个ncRNA。菌株A11全基因组序列在COG、GO和KEGG等数据库注释到的总基因数量为5 790个，其中COG数据库共注释到3 678个基因，GO数据库共注释到1 355个基因，KEGG数据库共注释到1 594个基因。
2.2.2 基因数据库注释分析
菌株A11的COG注释结果主要包含能量生成和转换(energy production and conversion)、氨基酸转运及代谢(amino acid transport and metabolism)、转录(transcription)以及无机离子转运(inorganic ion transport and metabolism)、脂肪转运代谢(lipid transport and metabolism)等几大分类，其中能量生成和转换包含281个基因，氨基酸转运及代谢基因数量为367个，转录相关基因数量为359个，无机离子转运注释基因265个，脂肪转运代谢基因251个。通过COG确定的氨基酸转运及代谢、无机离子转运等功能均与菌株固氮、溶磷、解钾等促生功能密切相关，通过调控相关酶活性来调控菌株的促生能力。
菌株A11在GO数据库分类注释结果：在一级分类结果中可知注释到生物过程的基因数量最多，其次是分子功能。在生物过程中，细胞过程(cellular process)和代谢过程(metabolic process)注释到的基因数量明显多于其他分类，分别注释到1 117个和1 010个基因。细胞组分中的细胞蛋白质复合体(protein-containing complex)中注释207个基因，细胞膜(membrane)共注释313个基因，是所有二级分类中基因数量最多的。分子功能中，基因注释数量最多的是结合(binding)及催化活性(catalytic activity)，注释基因数量分别为627个和901个。
KEGG分析结果：在一级分类中，代谢(metabolism)功能注释到的基因数量最多，共注释到2 007个基因，其中生物系统(overview)涉及353个基因，是所有二级分类中最多的。其次，氨基酸代谢(amino acid metabolism)也包含较多基因，注释到基因数量为331个。同时分别有254个基因和207个基因被注释到碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、辅助因子和维生素代谢通路(metabolism of cofactors and vitamins)中。初步推断这4类代谢途径在菌株A11促生功能中发挥重要作用。
2.2.3 促生功能基因分析
从菌株A11全基因组注释信息中获取了98个与菌株促生功能(固氮、溶磷、解钾)相关的基因信息，具体结果如表2所示。其中共50个与氮代谢相关的基因，参与编码谷氨酸和谷氨酰胺代谢与转运的基因家族主要包括glu、gltA、gltB、gltC、gltD、gltI、gltK、gltP、gltR、gltS、glnB、glnD、glnE、glnG、glnH、glnM、glnP、glnQ和glnS，以及氨转运与硝酸盐还原相关的基因amtB、nasA与nasD，功能注释结果表明以上基因在菌株固氮方面发挥重要的作用。关于解磷功能有关基因共筛选到29个，主要为编码谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase)基因gdh及其辅因子吡咯喹啉醌合成蛋白(pqq)相关基因。同时，磷酸盐转运系统主要涉及phnC、phnE、phnO、phnR、phnW与phnX基因，碱性磷酸酶有关基因簇(phoB, phoP, phoR, phoU)中的phoR-phoB双组分调节系统能够感应并调控环境中可利用的磷酸盐，与细菌解磷功能密切相关。菌株A11基因组中与钾代谢相关的基因共19个，其中钾转运相关kdp系统基因主要包括kdpA、kdpB、kdpC、kdpD及kdpE，是维持细菌K+稳态的核心系统，6个钾外排系统相关基因kef (kefC, kefF)，5个钾吸收有关基因kup、ktrA及ktrB等。此外，基因组信息还注释到了铁载体细菌外膜转运相关的vibB、fhu和fts基因，暗示其可能具有潜在的合成铁载体的促生功能。
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