BioSense全自动MIC最小抑菌浓度，动力学生长标准实验方案
一 实验前期准备（耗材、菌株、试剂、仪器预校准）
1 实验耗材与试剂配制
选用无吸附透明平底96孔微孔板，适配oCelloScope全深度Z轴扫描；配套透气疏水封板膜、无菌排枪、低温瞬时离心机、标准梯度稀释试管。
受试抗菌药物用对应无菌液体培养基溶解，配制10×最高母液浓度，经0.22μm滤膜无菌过滤，避光低温保存；空白培养基、阳性生长对照菌液、无菌水同步准备。
标准菌株复苏活化：细菌采用MH肉汤，丝状真菌采用RPMI 1640培养基，37℃/28℃恒温振荡活化12–18h，连续传代2次保证生理状态稳定；调整菌悬液至标准接种浓度，细菌终浓度5×10⁵ CFU/mL，真菌孢子终浓度1×10⁴ CFU/mL。
2 仪器预校准操作流程
提前24h启动外置恒温培养箱，稳定至实验设定温度；将oCelloScope主机放入箱内预热2h，接通电脑通讯，打开UniExplorer软件。
放入仅含空白培养基的微孔板，执行全局BCA基线校正，保存空白校正模板；使用原厂灰度校准板完成光路亮度校准，记录光源原始光强数值。
设置统一扫描基础参数：Z轴扫描覆盖孔底下方50μm至液面上方20μm，每10μm一层切片；曝光增益固定标准档位，开启SESA静态杂质像素过滤，关闭图像水印、超高分辨率渲染，降低扫描数据传输压力。
3 梯度加样排布规范（96孔板通用布局）
横向A–H行设置8个药物浓度梯度，每一行6个生物学复孔；
第11列设置阳性生长对照（仅菌液+培养基，无药物）；
第12列设置空白阴性对照（仅无菌培养基，无菌株无药物）；
外圈A1–A12、H1–H12、B1–G1、B12–G12全部填充无菌培养基作为蒸发缓冲孔，减少长周期液体蒸发与边缘温差。
药物梯度采用2倍倍比稀释，从最高浓度依次向下梯度稀释，保证孔内液体终体积统一100μL，药物稀释后体积误差控制在±2μL内。
二 微孔板加样、封板、上机标准化操作步骤
1 梯度稀释加样完整流程
每孔先加入50μL无菌MH/RPMI培养基；
第1列加入50μL 10×药物母液，充分吹打混匀后吸取50μL转移至第2列，依次倍比稀释，最后一列弃去50μL，保证每孔药物梯度体积一致；
除空白阴性孔外，所有孔加入50μL标准化菌悬液，轻柔吹打3次混匀，避免产生微小气泡；阴性对照孔补充50μL无菌空白培养基。
全部加样完成后，微孔板低速300g离心1min，将孔内微小气泡完全沉降至底部，防止气泡遮挡成像、造成假阳性信号。
2 封板与平衡处理
使用透气疏水封板膜完整密封微孔板，膜面无褶皱、无破损；膜与孔口之间不留空隙，避免水汽大量蒸发形成冷凝水滴落。
密封完成后将微孔板放置于与培养箱同温操作台静置30min，消除板体与箱体之间温差，减少盖板凝水。
3 仪器上机时序任务参数设置
将微孔板平稳放入oCelloScope板架，卡扣完全卡紧，不偏移、不翘起；
UniExplorer软件新建时序扫描任务，读取预先保存的BCA基线模板、Z轴扫描参数；
测量间隔设置：细菌MIC实验每30min扫描1次，总监测时长16–20h；丝状真菌MIC实验每60min扫描1次，总监测时长48–72h；
开启动态BCA实时基线校正、分层像素权重校正，上调底部Z轴切片权重，适配静置沉降菌体；
软件实验备注栏记录药物名称、梯度范围、菌株名称、接种浓度、培养温度、监测总时长，留存溯源信息。
确认全部参数后启动全自动无人值守时序扫描，全程不取出微孔板，维持稳定恒温静置环境。
三 动力学数据采集、MIC判定标准与校正流程
1 双定量指标同步采集规则
系统同步输出两类定量数据用于MIC判定：
第一类：全深度堆叠菌体像素总面积（成像核心指标，消除沉降贴底菌体定量偏低问题）；
第二类：TA等效总吸收浊度数值（对标传统酶标OD，用于横向文献对比）。
每一个时间点自动保存Z轴原始图像堆栈，曲线出现异常波动时可调取对应图像区分药物沉淀、结晶、气泡与真实菌体生长。
2 动力学MIC判定标准（动力学生长法，区别于终点目视法）
阳性对照孔正常出现典型S型生长曲线，延滞期、对数生长期清晰；阴性空白对照全程像素面积、TA数值无明显上升，基线波动在阈值范围内，实验整体质控合格。
逐梯度分析每一组复孔时序生长曲线：
药物最高浓度至临界抑菌浓度区间，菌体像素面积全程维持在空白基线水平，无持续上升趋势，判定为完全抑制；
降低一级药物浓度后，曲线出现明显持续上升，菌体像素随时间显著增加，代表菌株可正常增殖；
最小抑菌浓度MIC定义为：可完全抑制菌体持续生长的最低药物浓度，以全复孔像素面积无显著增长作为判定依据，不依靠单一终点数值。
3 数据校正与异常孔剔除规则
培养基析出结晶、药物沉淀产生静态像素信号，SESA算法自动过滤，若单孔沉淀过多导致基线漂移严重，直接标记该孔并剔除，使用其余复孔均值参与统计；
同一梯度6个复孔像素面积变异系数超过15%，排查是否存在加样误差、气泡、冷凝水滴落，对应时间段数据单独标注；
以阳性对照生长曲线作为内参校正，计算各药物浓度组相对生长率，相对生长率≤10%判定为有效抑菌。
四 数据导出、图表绘制与SCI方法学记录规范
1 标准化数据导出步骤
时序扫描全部结束后，终止扫描任务，备份完整工程文件夹；
导出CSV动力学数据，勾选像素总面积、TA吸收、各时间点原始数值，编码选择UTF-8格式，避免乱码；
批量导出关键时间点Z轴堆叠成像截图，保存延时生长视频作为补充材料；
单独导出每一组梯度的平均生长曲线、复孔标准差数据，用于Origin绘图。
2 图表分层绘制规范
图1：不同药物浓度梯度菌体像素面积时序动力学曲线，标注MIC临界浓度；
图2：对应时间点微孔原位成像对比图，直观展示不同浓度下菌体/菌丝生长差异；
图3：相对生长率柱状统计图，量化各浓度抑菌效果；
图4：像素面积-TA浊度相关性拟合图，完成双数据交叉验证。
3 论文方法学标准描述模板
采用BioSense oCelloScope系统开展微生物MIC动力学生长测定；菌株标准化接种于96孔透明平底微孔板，药物2倍倍比稀释；设备搭载FluidScope倾斜Z轴多层扫描，覆盖微孔全部液体深度，SESA图像分割算法定量菌体像素总面积；全程恒温静置原位连续监测，同步采集成像形态参数与等效TA浊度动力学数据；动态BCA基线校正消除沉淀、气泡干扰；MIC判定标准为完全抑制菌体持续增殖的最低药物浓度，以6个生物学复孔时序生长曲线综合判定，区别于传统终点目视浊度法。
五 实验质控与故障应急处理方案
1 全程质控关键点
每次实验同步设置阳性、阴性对照，无正常阳性生长曲线则整板数据作废；
监测中途若出现断电、软件断连，按照接续扫描流程恢复任务，标记断电时段，该区间数据不纳入MIC判定；
长周期真菌MIC实验每24h预览一次成像，发现盖板大量冷凝水则停机无菌擦拭板盖，平衡温度后继续扫描。
2 实验报废判定标准
冷凝水滴入微孔、菌体大面积移位、复孔变异系数高于30%、阳性对照无生长、图像堆栈大量损坏，整板实验作废，重新开展梯度稀释上机。