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大肠杆菌噬菌体Bp4抗性菌株与其敏感菌株培养特性及耐药性检测(一)

来源:中国预防兽医学报 发布时间:2024-06-15 19:22:27 浏览:12 次

早在上世纪30~40年代噬菌体就被用于治疗细菌感染,但随着抗生素的发现,因其高效杀菌、使用方便、价格便宜的特点,抗生素很快在世界各地得到广泛应用,逐渐代替了噬菌体。近年来,由于抗生素的滥用致使细菌耐药性产生甚至不断出现了多重耐药菌,寻找抗生素的替代品是目前的当务之急。噬菌体是能够特异性感染细菌的病毒[1],具有特异性的宿主识别谱,可实现对细菌的快速特异杀灭,其杀菌作用不受细菌耐药性的限制,且噬菌体具有研发周期短、投入成本低、安全性高等优点,成为最有影响力的抗生素替代品之一[2-3]。因此噬菌体疗法的研究及临床应用逐渐得到重视。


在细菌与噬菌体共同进化过程中,细菌不断演化出抵抗噬菌体的机制,噬菌体抗性菌的出现成为噬菌体治疗中的难题[4],噬菌体的抗性菌会不会像抗生素抗性菌一样最终面临无药可治的境地?噬菌体抗性细菌的出现往往与细菌的自发突变和适应性有关,且往往与噬菌体吸附受体的修饰有关。主要的噬菌体抗性机制是噬菌体抗性菌株能够通过表面修饰对噬菌体进行防御[5]。乐率研究发现,绿脓杆菌通过细胞表面外膜脂多糖的丢失从而产生了噬菌体抗性,且抗性菌的毒力显著下降[6]。本实验室前期分离到一株大肠杆菌噬菌体Bp4,属于短尾噬菌体科N4类噬菌体,能够裂解O78血清型的大肠杆菌。


本研究通过双层平板法筛选大肠杆菌噬菌体的抗性突变株,将其与大肠杆菌敏感菌株进行了形态及培养特性观察、血清型及耐药性检测、基因组测序分析等研究,以期为噬菌体治疗中噬菌体抗性菌的研究提供参考依据。


1材料与方法


1.1主要实验材料


大肠杆菌噬菌体Bp4、大肠杆菌血清O78型敏感菌株(后简称O78型敏感菌株)均由本实验室保存;BALB/c小鼠购自青岛大任富城畜牧有限公司。营养琼脂、LB肉汤、琼脂粉均购自生工生物工程(上海)有限公司;大肠杆菌O抗血清购自中国兽医药品监察所;药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。


1.2噬菌体抗性突变菌株的筛选与鉴定


将噬菌体Bp4的宿主菌(O78型敏感菌株)接种于5 mL LB液体培养基中,37℃220 r/min振荡培养至对数生长期后取200μL与200μL噬菌体Bp4的增殖液一起加入5 mL LB中,37℃220 r/min振荡培养,观察液体的浑浊状态;在约3 h液体清亮后继续振荡培养过夜至浑浊,用接种环采用三线法将该噬菌体增殖液接种于LB平板,37℃倒置培养过夜。将LB平板上长出的单菌落连续纯化4代,将第4代纯培养的单菌落再与噬菌体Bp4经液体培养后再经双层平板法培养[7],即用接种环挑取第4代纯培养的单菌落接种于5 mL LB中,37℃220 r/min振荡培养至对数生长期,取110μL菌液与110μL噬菌体Bp4增殖液混匀后于37℃孵育5 min,取200μL孵育液加至已溶解的上层琼脂中,混匀后迅速倾倒在下层营养琼脂上,晃匀待凝固后37℃倒置培养6 h~8 h,设不加噬菌体的敏感菌株为阳性对照。观察噬菌斑产生情况,不产生噬菌斑的菌株即为对噬菌体Bp4具有抗性的大肠杆菌突变菌株,命名为大肠杆菌O78-R型抗性菌株(后简称O78-R抗性菌株)。


1.3敏感菌株与抗性菌株的形态及培养特性


观察将O78型敏感菌株与O78-R抗性菌株分别在普通营养琼脂及麦康凯琼脂上划线培养,37℃16 h后观察菌落形态,挑取单菌落经革兰氏染色观察。挑取单菌落于5 mL LB液体培养基中,37℃220 r/min振荡过夜培养,利用倾注平板法[8]测定菌液浓度:将菌液10倍倍比稀释至107倍,分别选取105和107稀释度的菌悬液各1 mL于无菌培养皿中,然后将约50℃营养琼脂注入平板中晃匀,试验重复两次;待琼脂凝固后,将平板倒置于37℃温箱中培养24 h左右,经细菌计数评估两种细菌的生长速度。


1.4敏感菌株与抗性菌株的基因组测序及序列


分析将纯化的O78型敏感菌株及O78-R抗性菌株由北京安诺优达基因科技有限公司测序,根据测序结果分析比较抗性菌株与敏感菌株基因组的差异。


1.5敏感菌株与抗性菌株的血清型鉴定

将O78型敏感菌株与O78-R抗性菌株分别接种于5 mL LB肉汤中,37℃220 r/min振荡培养12 h后,4 000 r/min离心10 min,弃上清,用0.5%石炭酸生理盐水2 mL悬浮后121℃高压2 h,以破坏细菌的荚膜“K”抗原,制成高压抗原,以大肠杆菌O抗血清为抗体,利用玻板凝集法鉴定大肠杆菌的“O”抗原血清型。


1.6敏感菌株与抗性菌株的耐药性检测参照文献[9]采用药敏K-B纸片法分别检测O78型敏感菌株及O78-R抗性菌株对12种药物的敏感性,根据欧盟药敏试验标准判定结果。


1.7敏感菌株与抗性菌株的致病性试验将20只BALB/c小鼠随机分为两组,每组10只,分别腹腔注射O78型敏感菌株新鲜菌液及O78-R抗性菌株新鲜菌液0.2 mL(菌液浓度均为1×108cfu/mL),统计感染后72 h内两组小鼠的发病率和死亡率,并统计感染后12 h、24 h、36 h、48 h、72 h时每组小鼠的临床症状得分,判定标准为:死亡0分,濒临死亡1分,部分闭眼、眼周有渗出液2分,嗜睡、弓背3分,运动减少、被毛粗乱为4分,正常、健康者5分,绘制患病小鼠的计分及其存活率曲线。



2结果


2.1噬菌体抗性菌株的筛选与鉴定结果


分别取200μL培养至对数期的O78型敏感菌株菌液及噬菌体Bp4增殖液于5 mL肉汤中,振荡培养,可观察到液体从清亮-浑浊-清亮-浑浊的变化,取最后浑浊的液体划线传代,用噬菌体Bp4再感染第4代的菌液,液体一直处于浑浊状态,初步判断噬菌体Bp4不再感染该菌株;用第4代的菌液与噬菌体Bp4经双层平板培养6 h~8 h不再产生噬菌斑,而O78型敏感菌株的平板则产生了明显的噬菌斑(图1)。表明宿主菌(敏感菌株O78型)在与噬菌体Bp4相互作用中产生了对噬菌体Bp4耐受的菌株,即抗性菌株O78-R。

图1噬菌体Bp4抗性菌株的筛选与鉴定结果


2.2敏感菌株与抗性菌株的形态及培养特性

结果将抗性菌株与敏感菌株进行了形态及培养特性的比较,发现两株菌的菌落形态相同,在普通营养琼脂培养基上均呈表面光滑、半透明的单菌落(图2),在麦康凯培养基上呈粉红色小菌落,表面光滑。且抗性菌株与敏感菌株的生长速度相同,105稀释度的两株菌菌悬液生长的单菌落数量太多不予计数,107稀释度两株菌的菌悬液在37℃培养24 h时均生长出30个单菌落,且重复实验结果相同。表明,抗性菌株与敏感菌株的形态及培养特性相同,生长速度一致。

图2 O78敏感菌株与O78-R抗性菌株在普通营养琼脂培养基的培养结果



大肠杆菌噬菌体Bp4抗性菌株与其敏感菌株培养特性及耐药性检测(一)

大肠杆菌噬菌体Bp4抗性菌株与其敏感菌株培养特性及耐药性检测(二)

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